Metarhizium anisopliae : estudo funcional do gene emp1 e análise transcricional de quitinases em diferentes estágios de diferenciação celular

Abstract

Para infectar seus hospedeiros artrópodes, Metarhizium anisopliae produz uma série de enzimas hidrolíticas e diversas alterações morfológicas como a formação de estruturas denominadas de apressórios e blastosporos. Estas estruturas de infecção representam estágios cruciais de penetração e disseminação no inseto hospedeiro, respectivamente. Além disso, o apressório é uma estrutura conservada entre fungos entomopatogênicos e fitopatogênicos. O gene emp1 (codifica uma proteína de matriz extracelular de Magnaporthe grisea) parece ter um papel importante na diferenciação do apressório, bem como na patogenicidade e virulência. Um dos nossos objetivos foi avaliar a possível função de um ortólogo do gene emp1 em M. anisopliae pela análise do perfil transcricional e construção de mutantes funcionais por mutagênese insercional utilizando agrotransformação. Foram geradas linhagens transformantes contendo o cassete de inativação do gene emp1 (pPZP::bar::emp1), sendo este construído pela subclonagem das regiões flanqueadoras 5’ (1.515pb) e 3’ (1.513pb), fusionadas a um cassete de expressão do gene bar (3.500pb) que confere resistência a glifosinato de amônia. A freqüência de transformação observada nesta etapa de transformação foi superior a 60%, porém em apenas 1,5% dos transformantes há indícios de recombinação homóloga. Também foi analisado o perfil transcricional de emp1, sob três condições anteriormente padronizadas: células diferenciadas em apressório, hifas (crescimento vegetativo), e blastosporos, sendo observada a presença de transcritos deste gene em todas as condições testadas. Em uma segunda etapa deste trabalho, foi avaliado o perfil transcricional de quitinases putativas de M. anisopliae nos estágios de diferenciação celular de apressório, hifas e blastosporos. Esta classe de proteínas está diretamente envolvida no remodelamento da parede celular fúngica durante a diferenciação celular, como também na degradação da quitina da cutícula do hospedeiro durante a etapa de penetração. Originalmente foram caracterizados três genes para quitinases (chit1, chi2 e chi3), e a análise in silico do genoma revelou outras 20 quitinases putativas de Metarhizium. Essa diversidade pode ser responsável pelas diferentes funções que o conjunto de enzimas quitinolíticas tem na degradação de quitina durante o ciclo de vida e de infecção do fungo. É, portanto importante: (i) validar transcricionalmente as quitinases putativas e (ii) tentar atribuir função a cada uma delas. Para isso, procedemos a análise dos transcritos de cada uma das 23 quitinases putativas sendo sintetizados cDNAs a partir das três condições de diferenciação celular (apressório, hifas e blastosporos). Na condição de diferenciação a apressório dez espécies de transcritos foram detectadas sendo seis do subgrupo A, três do subgrupo B, uma do subgrupo D. Nenhum transcrito de quitinases do subgrupo C foi detectado nas condições testadas. Tanto em crescimento vegetativo quanto em blastosporos foram detectadas sete espécies de transcritos de quitinases do subgrupo A, e uma do subgrupo D. As quitinases do subgrupo B diferiram quanto a sua distribuição nas condições testadas: três espécies de transcritos foram detectadas durante o crescimento vegetativo e seis em blastosporos. O estudo envolvendo os diferentes genes putativos (emp1 e de quitinases) de M. anisopliae, sob as diversas abordagens, representa um importante precursor para nos fornecer indicativos sobre as funções destes genes no ciclo de vida e de infecção de Metarhizium.

To infect their arthropod hosts, Metarhizium anisopliae produces a series of hydrolytic enzymes and several morphological changes, including the formation of structures called appressoria and blastospores. These infective structures represent crucial stages of penetration and dissemination in the insect host, repectively. In addition, the appressorium is a structure conserved among phytopathogenic and entomopathogenic fungi. The emp1 gene (encodes an extracellular matrix protein) from Magnaporthe grisea showed an important role in appressorium differentiation, as well as pathogenicity and virulence. Our goal was evaluate the possible role of an ortholog gene emp1 in M. anisopliae by transcriptional analysis and construction of functional mutants by insertional mutagenesis mediated by agrotransformation. We generated transformants strains containing the gene inactivation cassette of emp1 (pPZP::bar::emp1), which was constructed by subcloning of flanking portions 5’ (1.515bp) and 3’ (1.513bp) fused in a expression cassette of bar gene (resistance to glufosinate ammonium). The frequency of transformation observed in this round was higher than 60%, but only 1,5% of the transformants there is evidence of homologous recombination. We also analysed the transcriptional profile of emp1 under three conditions previously standardized, such as differentiated cells in appressorium, hyphae (vegetative growth) and blastospores. Accordingly, we observed the presence of transcripts of this gene in all growth condition tested. In a second step of this work, we evaluated the transcriptional profile of putative chitinases of the M. anisopliae in those different stages of cellular diferentiation. This class of proteins is directly involved in fungal cell wall remodeling during cellular diferentiation, as well as degradation of chitin in the host cuticle during the penetration stage. Originally we characterized three genes of chitinases (chit1, chi2 and chi3), but apart from these, the in silico analysis of the genome revealed 20 putative chitinases. This diversity may be reponsible for differents functions that the set of chitinases enzymes have in the chitin degradation during the life and infection cycle of the fungus. It is therefore important: (i) validate transcriptionally the putative chitinases and (ii) attemping to assign function to each one of them. Chitinases transcript survey was performed using cDNAs from three cell types: appressorium, vegetative growth and blastospores. In the appressorium condition ten species of transcripts were detected being six from the subgroup A chitinases, three from group B and one from group D. No transcripts of subgroup C chitinases were detected. Both in vegetative growth and blastospores seven species of transcripts of the subgroup A, and one from group D were detected. Chitinases from subgroup B differed - three species of transcripts were detected during vegetative growth and six were detected in blastospores. This study of several putative genes (as emp1 and chitinases) of M. anisopliae, under different approaches, may represent an important preliminary outcome to shed a light in the functions of these genes during life cycle and infection of Metarhizium.