Papel dos canais K+ATP na resposta eletrofisiológica ao FSH e ao isoproterenol em células de Sertoli

Abstract

O hormônio folículo-estimulante (FSH) produz um efeito dual sobre o potencial de membrana das células de Sertoli, com uma fase inicial rápida, que compreende uma hiperpolarização, por um período de segundos e uma fase de despolarização, que ocorre mais lentamente, por um período de minutos. A fase de despolarização envolve um mecanismo relacionado à entrada de cálcio estimulada pelo FSH. O Isoproterenol, um agonista de receptores β-adrenérgicos, induz uma hiperpolarização imediata e prolongada na membrana de células de Sertoli de ratos imaturos. Este efeito é provavelmente resultante da queda de [ATP]i a qual libera a inibição exercida pelo nucleotídeo sobre o canal de K+ATP. Dessa forma, objetivou-se estudar a ação do Isoproterenol sobre o potencial de membrana das células de Sertoli para melhor avaliar o componente hiperpolarizante produzido por FSH nas células de Sertoli, além de estudar a captação de Ca2+ estimulada pelo FSH e pelo isoproterenol. O potencial de membrana foi registrado utilizando túbulos seminíferos isolados de testículos de ratos Wistar machos de 15 dias de idade. O registro intracelular da célula de Sertoli foi realizado utilizando microcapilares preenchidos com KCl 3mmol/L acoplados a um eletrômetro. Foi realizada a aplicação tópica isolada de FSH (4mU/mL) e Isoproterenol (2μM). Depois, em experimentos individuais, foram aplicados topicamente, FSH e isoproterenol, 5 minutos após a aplicação tópica da Tolbutamida (10μM) e Glibenclamida (10μM), sulfonilureias de ação hipoglicemiante, que exercem efeito de fechamento dos canais de K+ATP. A Tolbutamida (10μM), ainda, foi perfundida 15 minutos antes da aplicação do Isoproterenol, a fim de testar se esta sulfoniluréia impediria de forma mais significativa a ação deste. Na técnica de captação de Ca2+, utilizou-se FSH e isoproterenol com toxina pertussis (PTX), bloqueador da subunidade Gi da proteína G para avaliar o seu envolvimento na captação de Ca2+ nas células de Sertoli de ratos imaturos. Utilizou-se a toxina colérica, estimulador da proteína Gs, para avaliar o envolvimento do AMPc na captação de Ca2+ nas células de Sertoli de ratos imaturos. Fez-se uso de SQ22536, inibidor da enzima adenilato ciclase, para avaliar o envolvimento dessa enzima na ação estimulante do FSH nas células de Sertoli de ratos imaturos. Os resultados foram dados como média ± SEM. Os dados da variação do potencial de membrana foram analisados pelo teste ANOVA para medidas repetidas com o pós-teste de Bonferroni. O FSH teve sua hiperpolarização inibida quando foi aplicado tolbutamida (10μM) anteriormente. O SQ22536 também aboliu a hiperpolarização causada pelo FSH. O Isoproterenol, quando aplicado isoladamente produziu uma resposta hiperpolarizante sobre o potencial de membrana, alterando de – 32,4mV ± 1,32 mV para -40,0 ± 0,78 mv, aos 60 segundos após a sua aplicação (*p<0,001) (n=6 células de Sertoli). A aplicação tópica de Tolbutamida (10 μM) bloqueou a ação do Isoproterenol (2μM), causando uma despolarização de –41,0± 0,47mV variou até -39,0 ± 2,02mV, aos 120 segundos após a aplicação do Isoproterenol (p>0,05) (n=6 células de Sertoli). A perfusão com Tolbutamida foi mais eficaz no bloqueio da resposta beta-adrenérgica, causando uma despolarização de -41,6 ±1,21 mV para -35,4 ± 0,98 mV, aos 120 segundos após a aplicação tópica do Isoproterenol (p>0,05) (n=9 células de Sertoli). A aplicação tópica de Glibenclamida (10μM), a qual é um inibidor do canal de k +ATP, bloqueou a ação do Isoproterenol (2μM), causando despolarização, demonstrando que a hiperpolarização do isoproterenol está relacionada com a abertura desses canais. A tolbutamida (10μM), quando aplicada topicamente, impediu a fase de hiperpolarização característica causada pelo FSH (4mU/mL), causando despolarização do potencial de membrana das células de Sertoli de ratos imaturos. O Isoproterenol apresentou uma resposta hiperpolarizante rápida sobre o potencial de membrana, causada, provavelmente, por uma abertura dos canais de K+ATP na membrana das células de Sertoli de testículos de ratos imaturos. PTX quando aplicada topicamente e anteriormente à aplicação de isoproterenol não impediu a hiperpolarização característica causada por isoproterenol. A ação hiperpolarizante de isoproterenol independe de proteína Gi. PTX não impede a captação de 45Ca2+ estimulada pelo isoproterenol. A toxina colérica, que estimula proteína Gs, não estimula a captação de 45Ca2+ nas células de Sertoli de ratos imaturos.

Follicle-stimulating hormone (FSH) produces a dual effect on the membrane potential of Sertoli cells, with an initial rapid phase, which comprises a hyperpolarization for a period of seconds and a depolarization phase, wich occurs more slowly, within minutes. The depolarization phase involves calcium entry stimulated by FSH. Isoproterenol, an agonist of β-adrenergic receptors, induces an immediate and prolonged hyperpolarization on the membrane of Sertoli cells from immature rats. The aim of this work is to study the involvement of K+ATP channels in the hiperpolarization effect of isoproterenol on the membrane of Sertoli cells. This work also aimed to study the action of Isoproterenol on the membrane potential of Sertoli cells to better understanding the hyperpolarizing component produced by FSH in Sertoli cells, in addition to study the Ca2+ uptake stimulated by FSH and by isoproterenol. Membrane potential was recorded using isolated seminiferous tubules of testes of 15 days-old rats. The record of intracellular Sertoli cell was performed using microcapillary filled with KCl3 mmol/L coupled to an electrometer. We performed a single topical application of FSH(4mU/mL) and Isoproterenol (2μM). Then, inindividual experiments were applied topically, FSH and isoproterenol, 5 minutes after topical application of Tolbutamide (10μM) and glibenclamide(10μM), sulfonylurea a hypoglycemicaction, exercising effect closing of K+ channels ATP. The Tolbutamide (10μM) also was infused 15 minutes before application of Isoproterenol in order totest whether this would prevents ulfonylurea most significantly to the action of isoproterenol. In the technique of 45Ca2+ uptake, we used FSH and isoproterenol with pertussis toxin (PTX), blocking the G protein subunit Gi to evaluate its involvementon Ca2+ uptake in Sertoli cells from immature rats. We used the cholera toxin, a stimulator of Gs protein, to evaluate the involvement of AMPc on Ca2+ uptake in Sertoli cells from immature rats. SQ22536, an inhibitor of the enzyme adenylate cyclase, was used to evaluate the involvement this enzyme in the stimulatory action of FSH in Sertoli cells from immature rats. The results were given as mean ± SEM. The data of the change in membrane potential were analyzed by ANOVA for repeated measures with Bonferroni post-test. The hyperpolarization produced by FSH was inhibited when tolbutamide was applied (10μM). The SQ22536 also abolished the hyperpolarization caused by FSH. The Isoproterenol when used alone produced a hyperpolarizing response on the membrane potential , changing from -32.4mV±1.32 mV to -40.0±0.78 mV at 60 seconds after its application (*p<0.001) (n=6Sertoli cells). Topical application of Tolbutamide (10μM) blocked the action of Isoproterenol (2μM), causing a depolarization of -41.0±0.47 mV ranged up to-39.0± 2.02 mV at 120 seconds after application of Isoproterenol (p>0.05) (n=6Sertoli cells). The Tolbutamide infusion was more effective inblocking beta-adrenergic response, causing a depolarization of -41,6 ±1,21 mV to -35,4 ± 0,98 mV at 120seconds after the topical application of Isoproterenol (p>0.05) (n=9Sertoli cells). Isoproterenol produces a rapid hyperpolarization on membrane potential of Sertoli cells. This effect was blocked by tolbutamide, indicating that the activation of beta-adrenergic receptors involves opening of K+ATP channels in the membrane of Sertoli cells from immature rat testes. PTX,when applied topically prior to application of isoproterenol did not prevent the characteristic hyperpolarization caused by isoproterenol. The hyperpolarizing action of isoproterenol is independent of Gi protein. PTX does not prevent the uptake of 45Ca2+ stimulated by isoproterenol. The cholera toxin, which stimulates Gs protein, does not stimulate 45Ca2+ uptake in Sertoli cells from immature rats.