Purificação e caracterização da bacteriocina cereína 8A, produzida por uma linhagem de Bacillus cereus

Abstract

Foi estudada uma bacteriocina produzida por uma linhagem de B. cereus 8A, isolado de solo da região Sul do Brasil. Na primeira etapa de estudo determinaram-se as condições básicas de produção de bacteriocina com amplo espectro de ação denominada de Cereína 8A. Observou-se que durante a fase estacionária ocorre o máximo da sua produção, iniciando sua síntese no final da fase exponencial. As condições de maior produção foram a 30º C, agitação e contínua e numa faixa de pH de 7,0-8,5. A bacteriocina bruta inibiu várias bactérias indicadoras, como Listeria monocytogenes, Clostridium perfringens e Bacillus cereus. O teste de termoestabilidade mostrou a perda de atividade quando submetida a uma temperatura a partir de 87º C. Verificou-se a resistência da bacteriocina bruta frente à tripsina e papaína, mas não frente à proteinase K e pronase E. B. cereus e L. monocytogenes foram utilizadas como bactérias indicadoras para a determinação do modo de ação, após a determinação da dose bactericida de 200 UA mL-1 e 400 UA mL-1 respectivamente. A Cereína 8A demonstrou uma ação inibidora em culturas de Escherichia coli e Salmonella Enteritidis, quando tratadas com EDTA. A atividade esporicida foi observada contra esporos de B. cereus após tratamento com 400 UA ml -1. A análise da biomassa de L. monocytogenes e B. cereus após tratamento com a Cereína 8A, através da espectrofotometria de infravermelho determinou alteração no perfil, correspondente à fração dos ácidos graxos da membrana celular bacteriana. A substância peptídica foi separada por meio da precipitação com sulfato de amônio, extração com 1-butanol e aplicação em coluna de cromatografia por troca iônica tipo Q-Sepharose. A Cereína 8A purificada mostrou maior sensibilidade a proteases e ao calor e um peso molecular de aproximadamente 26 kDa. O espectro ultravioleta foi típico de um polipeptídeo e o espectro de infravermelho indica presença de grupamentos NH, acil e ligações peptídicas na sua estrutura. Uma hipótese do mecanismo de ação seria a desestruturação da membrana celular pela abertura de poros.

A bacteriocin produced by a strain of B. cereus 8A, isolated from soil of South of Brazil, has been studied. At the first phase of the study, the basic conditions for producing Cerein 8A – which is a bacteriocin with a wide range of action - have been established. The raw bacteriocin inhibited standard indicator bacteria such as: Listeria monocytoenes, Clostridium perfringens and Bacillus cereus. The thermostability test has shown the loss of activity at 87o C or higher. It has been verified that raw bacteriocin is resistant to trypsin and papain but not to proteinase K and pronase E. B. cereus and L. monocytogenes have been used to determine the mode of action after setting the bactericidal. The Cerein 8A developed an inhibitory action against cultures of Escherichia coli and S. Enteridis when treated with EDTA. The analysis of the cultures of L. monocytogenes and B. cereus after being treated with Cerein 8A, using infrared spectrophotometry, established a change in its profile that corresponds to a fraction of the fatty acids of the bacterial biomass. The peptide substance was separated by the following step: precipitation with ammonium sulphate, extraction with 1-butanol and ion exchange chromatography on Q-Sepharose ionic exchanges. Purified Cerein 8A has shown higher sensitivity to heat and proteases and molecular weight of about 26 kDa. The ultraviolet spectrum was typical of a polypeptide and the infrared spectrum indicates the presence of NH group, acil and peptide bond in its structure. One of the hypotheses for the mechanism of action would be the disintegration of the cellular membrane by the opening of pores.