Pesquisa de genes associados à virulência em cepas de Pasteurella multocida através da técnica de multiplex-PCR

Abstract

Os atuais sistemas de criação na avicultura, baseados na alta densidade populacional, aumentam os riscos de disseminação de enfermidades, especialmente das doenças respiratórias e daquelas cujos agentes etiológicos possuem mais de um hospedeiro. A Cólera Aviária (CA) possui estas características e geralmente apresenta-se de forma aguda e com altos índices de morbidade e de mortalidade. Apesar de representar uma das patologias aviárias que deve ser considerada para o diagnóstico diferencial de enfermidades com notificação obrigatória que cursam com morte súbita, a patogenia e os fatores de virulência envolvidos na CA ainda estão pouco elucidados. O objetivo deste trabalho foi pesquisar quinze genes associados à virulência em 25 amostras de Pasteurella multocida isoladas de casos de CA na região sul do Brasil através do desenvolvimento de protocolos de multiplex-PCR. Além disto, o presente estudo visou comparar a capacidade de tipificação capsular do método molecular com testes fenotípicos. Os protocolos de multiplex-PCR desenvolvidos foram capazes de detectar todos os genes propostos. Os genes ompH, oma87, sodC, hgbA, hgbB, exBD-tonB, nanB, hyaD-hyaC estiveram presentes em 100% das amostras (25/25). Os genes sodA e nanH em 96% (24/25), o gene ptfA em 92% (23/25) e o gene pfhA em 60% (15/25). Os genes toxA, bcbD, dcbF não foram identificados em nenhuma das amostras pesquisadas (0/25). A tipificação capsular através do teste molecular apresentou maior capacidade de detecção quando comparada aos testes fenotípicos, pois enquanto 36% (9/25) das amostras não foram identificadas pelo teste convencional, somente 8% (1/25) não foi tipificada através do multiplex-PCR. Foram obtidos seis diferentes perfis genéticos, sendo P1 (negativo para os genes toxA, dcbF e bcbD) o mais comum. Com este trabalho, concluiu-se que os protocolos de multiplex-PCR desenvolvidos tornam-se uma ferramenta bastante útil e rápida para a detecção simultânea dos genes de virulência. Apesar da alta frequência dos genes estudados e de todas as amostras pertencerem à mesma subespécie de P. multocida, foram observados seis perfis genéticos, os quais devem ser confirmados em um estudo com um maior número de amostras.

The current breeding systems in poultry, based on high population density, increases the risk of spread of pathologies, especially respiratory diseases and those whose etiologic agents have more than one host. Fowl Cholera (FC) has these features and generally is presented in an acute form and with high rates of morbidity and mortality. Even though it represents one of the several avian diseases that should be considered in the differential diagnosis of notifiable diseases that course with sudden death, pathogenesis and virulence factors involved in the FC are still poorly understood. The objective of this study was to investigate fifteen genes related with virulence in 25 samples of Pasteurella multocida isolated from FC cases in the southern region of Brazil through the development of multiplex PCR protocols. In addition, this study evaluated the ability of capsular typing comparing the method molecular with phenotypic tests. The multiplex-PCR protocols developed were capable to detect all the proposed genes. The genes ompH, oma87, sodC, hgbA, hgbB, exBD-tonB, nanB, hyaD-hyaC, bcbD and dcbF were present in 100% of the samples (25/25). Gene sodA and nanH in 96% (24/25), ptfA in 92% (23/25) and pfhA in 60% (15/25). Gene toxA, bcbD and dcbF were not identified in any of the samples studied (0/25). The capsular typing by molecular test presented a higher detection capability when compared to phenotypic tests, because while 36% (9/25) of 25 of samples were not identified by conventional testing, only 8% (1/25) was not typified by multiplex–PCR. Six different genetic profiles were obtained and P1 (negative to genes toxA, dcbF and bcbD) was the most common. With this work, it was concluded that the multiplex-PCR protocols developed can be a useful tool for rapid and simultaneous detection of virulence genes. Despite the high frequency of the analyzed genes and that all samples belong to the same subspecies of P. multocida, six genetic profiles were observed, which should be confirmed in a study with a larger number of samples.