Desenvolvimento de uma vacina recombinante para circovirose suína e ensaios para diagnóstico molecular de PCV2

Abstract

O circovírus suíno tipo 2 (PCV2) é o principal agente da síndrome multissistêmica do definhamento do suíno (SMDS), uma doença mundialmente disseminada e que provoca perdas econômicas significativas para a suinocultura. Visando contribuir no diagnóstico da síndrome, o presente trabalho padronizou e comparou testes para a detecção do PCV2. Para isso, foram utilizadas as técnicas de amplificação por círculo rolante (ACR) e variações da PCR (convencional, tempo-real e competitiva). Utilizando a ACR foi possível obter a amplificação total de genomas do PCV2, os quais foram clonados, sequenciados e agrupados no genótipo PCV2b. Os genomas clonados foram isolados, recircularizados e transfectados em células PK-15. Este procedimento possibilitou a recuperação do vírus infeccioso em títulos de até 105,55 DICC50/mL. Portanto, a ACR foi uma ferramenta útil em estratégias de isolamento e sequenciamento do vírus. No entanto, a ACR foi menos sensível que a PCR para fins de detecção do PCV2. No segundo estudo, buscando métodos auxiliares no diagnóstico da SMDS, dois ensaios para a quantificação do PCV2 foram desenvolvidos. Estes ensaios foram baseados nas técnicas de PCR competitivo (cPCR) e de PCR em tempo real. Visando determinar qual seria o mais adequado para estimar a carga viral do PCV2, os dois métodos foram comparados. Ambos os ensaios foram capazes de detectar diferenças significativas entre o número de cópias de DNA de PCV2 encontradas em tecidos de animais saudáveis e acometidos pela SMDS (≥ 2,5 log10). No entanto, uma diferença média de 1,8 log10 na carga viral foi encontrada entre ensaios, onde as maiores cargas virais foram detectadas pela PCR em tempo real. Outro objetivo deste trabalho foi gerar vacinas baseadas na proteína do capsídeo (Cap) do PCV2. Assim, no terceiro estudo, três baculovírus recombinantes foram construídos de modo a expressar a proteína Cap. Em dois recombinantes, a seqüência de nucleotídeos do peptídeo sinal (PS) da glicoproteína I do herpesvírus bovino (BoHV-gI) foi inserida na extremidade 5’ do gene cap (ORF2). Além disso, um recombinante contendo a seqüência de nucleotídeos do PS foi construído sem o sinal de localização nuclear (NLS) de proteína Cap. Através do ensaio de imunoperoxidase em monocamada (IPMA), antígenos de PCV2 foram detectados em células Sf21 infectadas pelos três vírus recombinantes. Este resultado sugere que os recombinantes construídos são potenciais candidatos vacinais, uma vez que eles foram capazes de produzir antígenos de PCV2.

Porcine circovirus type 2 (PCV2) is the major agent of postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS), a worldwide spread disease that causes significant economic losses to the swine productive chain. Aiming to contribute in the diagnosis of the syndrome, this thesis compared and developed tests for PCV2 detection. For this, multiply-primed rolling-circle amplification (MPRCA) and PCR-based assays (conventional, real-time and competitive) were tested. The MPRCA allowed amplifying the full-length PCV2 genomes, which were cloned, sequenced and grouped on PCV2b genotype. The cloned genomes were isolated from the plasmids, recircularized and used for transfection in PK-15 cells. This procedure led to the production of infectious virus to titres up to 105.55 TCID50/mL. It was concluded that MPRCA is a useful tool to amplify PCV2 genomes in sight of sequencing and virus isolation strategies. However, it was less sensitive than PCR for diagnostic purposes. In the second study, searching for methods in support to PMWS diagnosis, two PCR assays were developed: a competitive PCR (cPCR) and a SYBR green real-time PCR. The quantitative PCR methods were compared to determine which would be more suitable to estimate the PCV2 DNA load. Both assays were able to detect significant differences between the numbers of PCV2 DNA copies found in tissues of PMWS-affected and non-PMWS-affected pigs (≥2.5 log10). However, a mean difference of 1.8 log10 on the viral load was found between assays, where the highest viral loads were detected by SYBR green real-time PCR. In the work outlined herein, another purpose was to generate vaccine candidates based on PCV2 capsid protein (Cap). Therefore, in the third study, three types of recombinant baculoviruses were constructed to express the Cap protein. In two recombinants, the nucleotide sequence from the signal peptide (SP) of bovine herpesvirus glycoprotein I (BoHV-gI) was inserted at the 5’ end of the cap gene (ORF2). Additionally, one recombinant containing the SP nucleotide sequence was constructed lacking the nuclear localization signal (NLS) of Cap protein. Through immunoperoxidase monolayer assay (IPMA), the PCV2 antigen was detected in Sf21 cells infected by the three recombinant viruses. This result suggests that the recombinants here constructed are potential vaccine candidates, once they were able to produce PCV2 antigens.