Clonagem e expressão da proteína 14-3-3ε1 de Echinococcus granulosus em Escherichia coli

Abstract

O Echinococcus granulosus é um platelminto parasita da classe Cestoda, que tem, como hospedeiros definitivos, os canídeos, e, como hospedeiros intermediários mais comuns, ungulados domésticos e o homem. Este parasito é o agente etiológico da hidatidose cística, zoonose hiperendêmica no Cone Sul da América do Sul, incluindo o sul do Brasil. Para o estabelecimento e manutenção do cisto hidático por longos períodos de tempo (infecção crônica), o parasito secreta e expõe ao seu hospedeiro numerosas proteínas, que podem apresentar tanto atividade imunomoduladora, como estar relacionadas a atividades fisiológicas do parasito. As proteínas 14-3-3 constituem uma família altamente conservada de moléculas reguladoras eucarióticas, que são capazes de interagir com diferentes proteínas ligantes em diversos contextos celulares, regulando funções biológicas complexas. Em E. granulosus, foram identificadas cinco proteínas 14-3-3, sendo três isoformas ζ e duas isoformas ε. Essas proteínas podem estar envolvidas em interações parasito-hospedeiro que propiciam o estabelecimento e o desenvolvimento da forma larval patogênica (metacestódeo). Para a futura caracterização funcional da proteína 14-3-3e1 de E. granulousus (Eg14-3-3ε1), já detectada em componentes do metacestódeo, a sua sequência codificadora foi expressada em Escherichia coli. A clonagem foi realizada em dois vetores plasmidiais distintos (pGEX-TEV e pET-26b), para permitir a expressão em E. coli da proteína Eg14-3-3ε1 recombinante no citoplasma, em fusão com a GST, e no espaço periplásmatico, com cauda de histidina, respectivamente. A solubilização da Eg14-3-3ε1 em fusão com a GST foi obtida com 0,5% de sarcosil, mas no entanto não foi possível a sua purificação. A proteína Eg14-3-3ε1 com cauda de histidina foi obtida por extração da fração periplasmática seguida da purificação por cromatografia de afinidade, tendo sido obtido um rendimento final de 0,5 mg/l de cultura. A proteína Eg14-3-3ε1 recombinante purificada será futuramente utilizada em ensaios funcionais, buscando inicialmente a identificação de seus ligantes proteicos dentre o repertório de proteínas do parasito e do hospedeiro, no contexto da infecção crônica.

Echinococcus granulosus is a parasitc platyhelminth of the Cestoda class, wich has, canids as definitive hosts, domestic ungulates and humans as intermediate hosts. This parasite is the causative agent of cystic hydatid disease, a hyperendemic zoonosis in the Southern Cone of South America, including Southern Brazil. In order to the establishment and maintenance of hydatid cyst for a long period of time, the parasite secrets and exposes to its host numerous proteins, which may have immunomodulatory activity as well to be related to physiological activities of the parasite. The 14-3-3 proteins are a family of highly conserved eukaryotic regulatory molecules that are able to interact with different partner proteins in different cellular contexts, regulating complex biological functions. In E. granulosus five 14-3-3 proteins have been identified, three ζ isoform and two ε isoform. These proteins may be involved in host-parasite interactions that favor the establishment and growth of the pathogenic larval form (metacestode). For future functional characterization of the 14-3-3ε1 protein from E. granulousus (Eg14-3-3ε1) previously detected in metacestode components, its coding sequence was expressed in Escherichia coli. The cloning was done into two different plasmid vectors (pGEX-TEV and pET-26b), to produce recombinant Eg14-3-3ε1 protein in E. coli, in the cytoplasm, in fusion with GST, and periplasmatic with histidine tail, respectively. Solubilization of Eg14-3-3ε1 fused with GST was achieved with 0.5% sarcosil, yet it was not possible to purify it. The Eg14-3-3ε1 protein with histidine tail was obtained by extracting the periplasmic fraction from E. coli cultures, followed of purification by affinity chromatography, yielding 0.5 mg/l. The recombinant Eg14-3-3ε1 protein will be used in functional assays, initially aiming at the identification of protein ligands from the repertoire of proteins from the parasite and from host in the context of chronic infection.