Efeitos da metformina sobre a homeostase mitocondrial e redox em modelos celular e animal para a deficiência da sulfito oxidase

Abstract

A deficiência do cofator molibdênio (MoCD) é uma doença hereditária rara que afeta o metabolismo do enxofre, com grave sintomatologia, que ocorre devido a mutações nos genes que codificam enzimas envolvidas na biossíntese do cofator de molibdênio. Apesar de a MoCD afetar a atividade das enzimas sulfito oxidase (SO), aldeído desidrogenase e xantina desidrogenase, as quais são dependentes desse cofator, já está bem estabelecido que os sintomas são causados pela deficiência da SO. Mutações nos genes MOCS1, MOCS2 e GPHN resultam na MoCD tipo A, B e C, respectivamente. A doença é caracterizada bioquimicamente pelo acúmulo tecidual e elevada excreção urinária de compostos sulfurados, tais como sulfito, tiossulfato e S-sulfocisteína. Os pacientes apresentam sintomas neurológicos graves e anormalidades cerebrais, tais como encefalopatia, déficit psicomotor, convulsões, atrofia cortical e anormalidades nos gânglios da base. Apesar de os mecanismos fisiopatogênicos envolvidos na disfunção neurológica não estarem totalmente estabelecidos, trabalhos do nosso grupo demonstraram que os metabólitos acumulados causam disfunção bioenergética e induzem estresse oxidativo em cérebro de ratos. Saliente-se aqui que a SO, principal enzima deficiente nesse distúrbio, está localizada no espaco intermembrana da mitocôndria e, portanto, sugere-se que o maior acúmulo dos metabólitos ocorra nessa organela. Para explorar os mecanismos subjacentes da MoCD, avaliamos a função mitocondrial e a homeostase redox em fibroblastos de um paciente com MoCD tipo A (deficiência de MOCS1) e em um modelo animal em ratos Wistar através da administração intracerebroventricular (ICV) de sulfito. Dada a eficácia limitada dos tratamentos atuais para a doença, também investigamos o impacto da metformina nesses modelos. Em fibroblastos deficientes para a MOCS1, observamos diminuição da respiração basal, máxima e ligada ao ATP, juntamente com redução da capacidade respiratória de reserva. Além disso, os níveis das proteínas mitocondriais MFN1/2, OPA1, DRP1 e NRF1 estavam diminuídos, enquanto o conteúdo de p-DRP1 (Ser 637) estava elevado. Os níveis de superóxido também estavam aumentados nessas células. O tratamento com metformina reverteu essas alterações nos níveis proteicos. Além disso, a metformina aumentou a expressão de RNAm dos genes PRKAA1, PPARGC1A, SIRT1, DNM1L e mitofusina 1. Também foi observado um aumento na razão p- AMPK/T-AMPK induzido por metformina nos fibroblastos deficientes. Ainda, foi vista uma redução nos níveis de Sirt3, SOD2 e catalase, porém essas alterações não foram revertidas pela metformina. No modelo animal, a administração de sulfito prejudicou as defesas antioxidantes enzimáticas e não enzimáticas e alterou o funcionamento do ciclo do ácido cítrico e da cadeia de transporte de elétrons no estriado, córtex cerebral e cerebelo de ratos eutanasiados 2 e 24 h após a injeção. O pré-tratamento com metformina preveniu a disfunção bioenergética verificada no córtex cerebral e restaurou a homeostase redox no estriado. Nossos resultados indicam que a metformina induziu efeitos benéficos nos fibroblastos deficientes para a MOCS1 e mitigou os efeitos induzidos por sulfito no cérebro de ratos, modulando a biogênese e a fissão mitocondrial, sendo um promissor candidato farmacológico para o tratamento da MoCD.

Molybdenum cofactor deficiency (MoCD) is a rare and severe inborn error of sulfur metabolism caused by mutations in genes encoding the enzymes involved in the biosynthesis of the molybdenum cofactor. Although MoCD affects the activity of the enzymes sulfite oxidase (SO), aldehyde dehydrogenase and xanthine dehydrogenase, which are dependent on this cofactor, it is well known that the symptoms result from the deficient activity of SO. Mutations in MOCS1, MOCS2, and GPHN result in MoCD types A, B, and C, respectively. The disorder is biochemically characterized by the accumulation of sulfur-containing compounds such as sulfite, thiosulfate, and S-sulfocysteine in tissues, along with elevated urinary excretion of these metabolites. Clinically, patients exhibit severe neurological symptoms and brain abnormalities, including encephalopathy, psychomotor retardation, seizures, cortical atrophy, and basal ganglia involvement. Although the pathophysiological mechanisms underlying the neurological deterioration in MoCD remain to be established, our previous studies have shown that accumulated metabolites induce bioenergetic impairment and oxidative stress in the rat brain. SO, the deficient enzyme in MoCD, is localized in the mitochondrial intermembrane space, suggesting that the accumulation of toxic metabolites may be particularly detrimental to mitochondrial function. To investigate the molecular mechanisms involved, we assessed mitochondrial function and redox homeostasis in fibroblasts derived from a patient with MoCD type A (MOCS1 deficiency) and in Wistar rats subjected to intracerebroventricular (ICV) injection of sulfite (animal model). Considering the limited efficacy of current therapeutic options, we also examined the potential protective effects of metformin in both models. In MOCS1-deficient fibroblasts, we observed a marked reduction in basal, maximal, and ATP-linked respiration, along with decreased spare respiratory capacity. Protein levels of MFN1/2, OPA1, DRP1, and NRF1 were significantly reduced, while levels of p-DRP1 (Ser 637) were elevated. Additionally, mitochondrial superoxide levels were increased. Metformin treatment reversed these protein alterations. Furthermore, metformin upregulated the mRNA expression of the genes PRKAA1, PPARGC1A, SIRT1, DNM1L, and MFN1. It also increased the p-AMPK/T-AMPK ratio in deficient fibroblasts. Although reduced levels of Sirt3, SOD2, and catalase were observed, these changes were not reversed by metformin. In the animal model, sulfite administration disrupted both enzymatic and non-enzymatic antioxidant defenses and impaired the citric acid cycle and electron transport chain in the striatum, cerebral cortex, and cerebellum at 2 and 24 h post-injection. Metformin pretreatment prevented cortical bioenergetic dysfunction and restored striatal redox balance. Collectively, our findings demonstrate that metformin exerts beneficial effects in MOCS1-deficient fibroblasts and ameliorates sulfite-induced mitochondrial dysfunction in the rat brain, primarily by modulating mitochondrial biogenesis and fission. These results support the potential of metformin as a promising pharmacological candidate for MoCD treatment.