Diferenças no padrão de respostas inflamatórias em ratos Wistar neonatos submetidos à hipóxia-isquemia em dois momentos do desenvolvimento

Abstract

Apesar da neuroinflamação mediar o dano causado pela hipóxia isquemia neonatal (HI), há uma escassez de estudos sobre diferenças no padrão de respostas inflamatórias após à HI, o qual envolve resposta de células gliais e secreção de citocinas especificas. O presente trabalho teve como intuito investigar as diferenças no padrão das respostas inflamatórias entre animais submetidos à HI realizada no dia pós-natal (DPN) 3 (HIP3), e à HI realizada no DPN 11 (HIP11). Filhotes de ratos Wistar foram submetidos ao modelo de HI neonatal no DPN 3 (n=19) e no DPN11 (n=18). Os animais foram avaliados nestes dois períodos do neurodesenvolvimento, sendo que os animais HIP3 mimetizam recém-nascidos prematuros e os HIP11 recém-nascidos a termo. Os animais foram eutanasiados 72 horas após o procedimento cirúrgico. Os encéfalos foram retirados, crioprotegidos, fatiados e colocados sobre lâminas histológicas. Foram utilizados os anticorpos primários: neuronal nuclei protein (NeuN), glial fibrillary acidic protein (GFAP) e ionized calcium-binding adaptor molecule 1 (Iba-1) para a marcação por imunofluorescência de neurônios, astrócitos e micróglia, respectivamente, nas regiões de CA1 e CA3 do hipocampo. Foram utilizadas 3 fatias por animal e as imagens foram analisadas utilizando uma região de interesse. Para as análises de volume de lesão, os cortes de encéfalo foram corados com hematoxilina-eosina e a análise volumétrica das áreas de interesse (hemisfério e hipocampo) foi realizada pelo método de Cavalieri. As proteínas interleukin 1 Beta (IL-1β), interleukin 10 (IL-10), extracellular signal-regulated kinase (ERK) e phosphorylated extracellular signal-regulated kinase (ERK fosforilada) foram quantificadas por western blot. Em lâminas marcadas com Iba-1 foi feita a análise de fenótipo microglial. Os animais HIP11 apresentaram um maior dano tecidual nas estruturas analisadas. Na região de CA1 houve uma menor intensidade de fluorescência ipsi/contralateral para NeuN, bem como um aumento na intensidade para GFAP e Iba-1 quando comparado com o grupo sham. Na região CA3, houve um aumento na imunofluorescência para Iba-1 se comparados ao sham e ao HIP3, sem diferenças significativas para NeuN e GFAP. Nos animais HIP3 observou-se um aumento na imunofluorescência de GFAP sem diferenças para NeuN e Iba-1 quando comparado ao Sham. Para CA3 houve uma tendencia a diminuição para NeuN e a aumento para GFAP. Não foi encontrada diferença estatística nas proteínas quantificadas por western blot. Em CA1 no fenótipo microglial foi observada diferença entre o sham e HIP3, sendo que este possui mais micróglias ameboides e menos micróglias ramificadas em CA3 não foi observada diferença estatística. Os achados sugerem que os animais HIP3 apresentam uma menor resposta neuroinflamatória associada à HI neonatal.

Although neuroinflammation mediates the damage caused by hypoxic neonatal ischemia (HI), there is a lack of studies on differences in the pattern of inflammatory responses after HI, which involves glial cell responses and secretion of specific cytokines. The present work aimed to investigate the differences in the pattern of inflammatory responses between animals subjected to HI performed on postnatal day (DPN) 3 (HIP3), and HI performed on PND 11 (HIP11). Wistar rat pups were subjected to the neonatal HI model on PND 3 (n=19) and PND11 (n=18). The animals were evaluated in these two periods of neurodevelopment, with HIP3 animals mimicking premature newborns and HIP11 mimicking full-term newborns. The animals were euthanized 72 hours after the surgical procedure. The brains were removed, cryoprotected, sliced and placed on histological slides. The primary antibodies were used: neuronal nuclei protein (NeuN), glial fibrillary acidic protein (GFAP) and ionized calcium-binding adapter molecule 1 (Iba-1) for immunofluorescence labeling of neurons, astrocytes and microglia, respectively, in the regions of CA1 and CA3 of the hippocampus. Three slices per animal were used and images were analyzed using a region of interest. For lesion volume analyses, brain sections were stained with hematoxylin-eosin and volumetric analysis of the areas of interest (hemisphere and hippocampus) was performed using the Cavalieri method. The proteins interleukin 1 Beta (IL-1β), interleukin 10 (IL-10), extracellular signal-regulated kinase (ERK) and phosphorylated extracellular signal-regulated kinase (phosphorylated ERK) were quantified by western blot. Microglial phenotype analysis was performed on slides labeled with Iba-1. HIP11 animals showed greater tissue damage in the structures analyzed. HIP11 animals showed greater tissue damage in the structures analyzed. In the CA1 region there was a lower ipsi/contralateral fluorescence intensity for NeuN, as well as an increase in intensity for GFAP and Iba-1 when compared to the sham group. In the CA3 region, there was an increase in immunofluorescence for Iba-1 compared to sham and HIP3, without significant differences for NeuN and GFAP. In HIP3 animals, an increase in GFAP immunofluorescence was observed without differences for NeuN and Iba-1 when compared to Sham. For CA3 there was a decrease tendency for NeuN and increase for GFAP. No statistical difference was found in the proteins quantified by western blot. In CA1, a difference was observed between sham and HIP3 in the microglial phenotype, with the latter having more amoeboid microglia and fewer ramified microglia. In CA3, no statistical difference was observed. The findings suggest that HIP3 animals have a lower neuroinflammatory response associated with neonatal HI.