Estabelecimento de uma reação em cadeia da polimerase em tempo real para detecção de animais persistentemente infectados pelo vírus da diarréia viral bovina

Abstract

O Brasil é um grande produtor de alimentos e a bovinocultura tem grande importância econômica e social. Doenças virais podem ter grande impacto na pecuária e, por isso, a identificação do agente, o conhecimento de sua epidemiologia e o desenvolvimento de técnicas eficientes para seu diagnóstico são medidas extremamente importantes no seu controle. A diarréia viral bovina (“bovine viral diarrhea”- BVD) é uma enfermidade difundida nos rebanhos bovinos ocasionando grandes perdas econômicas em rebanhos de corte e leite em todo mundo. A identificação de animais persistentemente infectados (PI) pelo vírus da BVD (BVDV) é essencial em um programa de controle desta doença. No presente estudo, foi estabelecida uma transcrição reversa seguida da reação em cadeia da polimerase quantitativa (RT-qPCR) específica para identificação e quantificação dos diversos genótipos de pestivírus. Foi utilizado o teste de imunoperoxidase (IPX) como referência, além de outros testes de diagnóstico, como transcrição reversa seguida da reação em cadeia da polimerase (RTPCR), isolamento viral (IV), ELISA de captura de antígeno (ECA) e imunohistoquímica (IHQ). Os valores usados como base para quantificação foram pré-determinados pelo resultado da IPX de uma amostra padrão. A sensibilidade da RT-qPCR foi de 103,9 TCID50/mL, apresentando valor de coeficiente de correlação de 0,978 que permite identificar 95% das infecções com até 450,66 partículas virais/mL de soro. O coeficiente de variação da reprodutibilidade variou de 4 a 9%. Foram analisadas 72 amostras de soro sanguíneo de animais suspeitos de apresentarem infecção persistente pelo BVDV. Os títulos obtidos através da IPX a partir de soro de animais PI variaram de 105,55 a 107,3 TCID50/mL, enquanto que os títulos das amostras testadas pela RTqPCR variaram de 106,2 a 107,6 TCID50/mL. Os diferentes métodos laboratoriais utilizados para detectar o BVDV em rebanhos apresentaram a mesma eficiência entretanto, a utilização comparativa destes métodos aliada a uma nova estratégia permitiu que se estabelecesse uma RT-qPCR específica para detecção e quantificação do BVDV em amostras de soro de animais PI que poderá ser utilizada como uma importante ferramenta para o diagnóstico de pestivírus com diferentes características genéticas. Além disso, o presente trabalho poderá servir como base para a quantificação do agente em diferentes órgãos dos animais PI, o que contribuirá para o entendimento da patogenia do BVDV.

Brazil is an important food producer and cattle production has great economical and social importance. Viral diseases are constant problems and the identification of the agent, the knowledge of the disease´s epidemiology and the development of efficient diagnostic techniques are extremely important for its control. Bovine viral diarrhea (BVD) is a widespread disease causing great economical losses around the world. The identification of persistently infected animals (PI) in bovine herds is essential to the implementation of control programs. In the present study, a reverse transcription followed by quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) was established to the identification and quantification of pestivirus. Immunoperoxidase (IPX) was used as the reference test, in addition with reverse transcription followed by the polymerase chain reaction (RT-PCR), virus isolation (VI), antigen-capture ELISA (ACE) and Immunohistochemistry (IHC). The values used as standard to quantification were predetermined by the result from the IPX using a reference strain. The sensitivity of RTqPCR was 103.9 TCID50/mL, showing 0.978 of coefficient correlation, what allowed to detect 95% of infections with up to 450.66 viral particles/mL. The reproducibility of the coefficient of varied from 4 to 9%. Seventy-two samples of blood serum from animals suspected of presenting persistent infection of BVDV were analyzed. The titers obtained through the IPX from the serum of PI animals varied from 105.55 to 107.3 TCID50/mL, while the titers from the tested samples by the RT-qPCR varied from 106.2 to 107.6TCID50/mL. The different laboratory methods tested were capable of detecting the BVDV with equal efficiency, The comparative utilization of these methods allied with a new strategy allowed the establishment of a specific RT-qPCR protocol to quantify and detect the BDVD in PI sera which can be used as an important tool to the detection and quantification of the pestivirus different genetic backgrounds. Beyond this, the present protocol can be used to quantify the virus in different organs of PI animals and will contribute for the understanding of BVDV patogenicity.