Avaliação da PCR digital para detecção de enterobacterales e genes carbapenemases diretamente de amostras clínicas

Abstract

A resistência antimicrobiana em infecções da corrente sanguínea (ICS) causadas por Enterobacterales resistentes aos carbapenêmicos representa um dos maiores desafios globais de saúde. Os métodos tradicionais de hemocultura apresentam baixa sensibilidade e resultados tardios, dificultando decisões terapêuticas em tempo hábil. A PCR digital (dPCR) oferece vantagens potenciais devido à alta sensibilidade e precisão na detecção de genes que permitem a identificação bacteriana bem como a detecção de marcadores de resistência. Este estudo avaliou o desempenho da dPCR na detecção de Enterobacterales e genes de carbapenemase (blaKPC e blaNDM) a partir de colônias bacterianas, de amostras de sangue e plasma artificialmente contaminadas e de sangue total de pacientes com ICS. O DNA foi extraído utilizando o sistema Maxwell RSC e analisado por dPCR com alvos para Enterobacterales, blaKPC, blaNDM e RNAse P. Foram analisados 21 isolados bacterianos com perfis de resistência confirmados por sequenciamento genômico completo. Em baixas concentrações de DNA (0,01 ng/μL), a dPCR demonstrou 97,4% de sensibilidade e 100% de especificidade. Na segunda parte do estudo, dez isolados portadores dos genes blaKPC e/ou blaNDM foram utilizados para contaminar amostras de sangue e plasma em concentrações variando de 10⁵ a 10² UFC/mL. O método apresentou desempenho ideal (100% de sensibilidade e especificidade) nas concentrações bacterianas mais altas (10⁵–10⁴ UFC/mL), com queda de desempenho em concentrações mais baixas (10³–10² UFC/mL). A extração a partir de sangue total apresentou melhores resultados em comparação com o plasma. Adicionalmente, seis amostras de sangue total de pacientes com hemoculturas positivas foram testadas. A concordância com a hemocultura variou conforme o alvo: blaKPC apresentou o maior índice de concordância (83%), enquanto Enterobacterales e blaNDM apresentaram 67%. Sendo que a detecção específica de K. pneumoniae no sangue total de pacientes com hemocultura positiva com esta bactéria apresentou 100% de concordância com a dPCR. A dPCR demonstra potencial promissor para detecção rápida de bactérias e genes de resistência em infecções da corrente sanguínea, especialmente em cargas bacterianas elevadas. Apesar de limitações relacionadas ao volume de amostra e à eficiência de extração, o método oferece vantagens para o monitoramento da carga bacteriana e suporte à tomada de decisão terapêutica. A otimização futura dos processos pré-analíticos pode aumentar ainda mais sua aplicabilidade clínica.

Antimicrobial resistance (AMR) in bloodstream infections (BSIs) caused by carbapenem-resistant Enterobacterales (CRE) is one of the majors global health challenges. Traditional blood culture methods suffer from low sensitivity and delayed results, hampering timely treatment decisions. Digital PCR (dPCR) offers potential advantages through high sensitivity and precision in detecting resistance genes. This study evaluated the performance of digital PCR (dPCR) for detecting Enterobacterales and carbapenemase genes (blaKPC and blaNDM) from bacterial colonies, artificially spiked blood and plasma samples, and whole blood from patients with bloodstream infections (BSIs). DNA was extracted using the Maxwell RSC system and analyzed by dPCR targeting Enterobacterales, blaKPC, blaNDM, and RNAse P. A total of 21 bacterial isolates with resistance profiles confirmed by whole-genome sequencing were analyzed. At low DNA concentrations (0.01 ng/μL), dPCR demonstrated 97.4% sensitivity and 100% specificity. In the second phase of this study, ten isolates carrying blaKPC and/or blaNDM were used to spike blood and plasma samples at concentrations ranging from 10⁵ to 10² CFU/mL. The method showed optimal performance (100% sensitivity and specificity) at higher bacterial concentrations (10⁵–10⁴ CFU/mL), with decreased performance at lower concentrations (10³–10² CFU/mL). Whole blood extraction yielded better results than plasma. Additionally, six whole blood samples from patients with positive blood cultures were tested. Concordance with blood culture varied by target: blaKPC showed the highest agreement (83%), while Enterobacterales and blaNDM targets showed 67%. Notably, the specific detection of Klebsiella pneumoniae in whole blood from patients with positive blood cultures for this organism demonstrated 100% concordance with dPCR. Digital PCR shows promise for rapid detection of bacteria and resistance genes in bloodstream infections, particularly at higher bacterial loads. Despite limitations in sample volume and extraction efficiency, the method offers advantages for monitoring bacterial load and supporting timely antimicrobial therapy decisions. Future optimization of pre-analytical processes could further enhance clinical utility.