Diagnóstico de parvovirus e estudo de co-infecções por vírus de suínos

Abstract

A parvovirose suína está mundialmente distribuída tornando-se responsável por expressivas perdas econômicas devido aos problemas reprodutivos. O presente trabalho teve como objetivo realizar a padronização da PCR em tempo real (qPCR) utilizando sonda TaqMan para detecção e quantificação de parvovirus suíno 1 (PPV1) em amostras de soro, baseado na região do gene NS1. A especificidade, sensibilidade, reprodutibilidade e quantificação da qPCR foram avaliadas e a casuística foi comparada com a nested PCR (nPCR). A curva padrão da qPCR apresentou linearidade de 6 x 106 cópias genômicas/mL (gce/mL) a 2 x 103 gce/mL, com um coeficiente de correlação (R2) de 0,98. No teste de especificidade, a qPCR não apresentou valores de Cycle threshold (Ct) nos patógenos do grupo de exclusão (circovirus suíno tipo 2, parvovirus canino, vírus da panleucopenia felina, , Erisipela e Leptospirose). Todas as cepas de PPV1 testadas apresentaram fluorescência, demonstrando uma especificidade de 100%. Comparando as duas técnicas, 11 amostras foram positivas em ambos os testes e a nPCR detectou quatro amostras a mais do que a qPCR. A concordância, sensibilidade e especificidade entre as técnicas foi de 98%, 73% e 100%, respectivamente. Portanto, a nPCR apresentou maior sensibilidade, no entanto, a qPCR poderá ser utilizada no diagnóstico e quantificação de PPV1, podendo auxiliar em estudos de viremia, epidemiologia e monitoramento do vírus nas granjas. No segundo estudo, foi realizada a detecção por PCR de circovírus suíno tipo 2 (PCV2), PPV1, parvovírus suíno tipo 2, torque teno vírus suíno 1 e 2 (TTV1 e TTV2) e hokovirus suíno (PHoV) em pools de órgãos (linfonodos, pulmões, fígado, baço e rim) de leitões apresentando a Sídrome Multissistêmica do Definhamento Suíno (PMWS). Todas as amostras foram PCR positivas para PCV2 e os outros vírus foram detectados em todos os rebanhos, com exceção do TTV1. As amostras também foram positivas na PCR para PPV1 (81,6%), PPV2 (73,7%), TTV1 (5,3%), TTV2 (86,8%) e PHoV (55,3%). Os resultados indicam que leitões com PMWS e infectados com PCV2 apresentaram co-infecções com outras espécies de parvovirus e anelovirus, que podem estar envolvidos na apresentação da PMWS. Devido às poucas informações sobre a variabilidade genética do PHoV, oito fragmentos sobrepostos da região VP1/VP2 de quatro amostras foram amplificados e sequenciados. Na análise filogenética, as amostras brasileiras de PHoV apresentaram-se mais estreitamente relacionadas às amostras européias. O presente trabalho relata a primeira detecção de PPV2 e PHoV em co-infecções com PCV2 e a primeira caracterização genética de amostras de PHoV no Brasil.

Porcine parvovirus 1 (PPV1) has worldwide distribution and causes an important reproductive losses. The present dissertation was performed to develop a real-time polymerase chain reaction (real-time PCR) using a TaqMan probe based on NS1 gene to detect and quantify PPV1 in serum samples. The specificity, sensitivity, reproducibility and quantitative range of the real time PCR were evaluated and compared with conventional nested PCR (nPCR). The standard curve of real-time PCR was linear ranging from 6 x 106 genome copies equivalent/mL (gce/mL) to 2 x 103 gce/mL with a square of the correlation coefficient (R2 value) of 0.98. No cross-reactivity was detected with closely related parvovirus or with viruses that causes similar symptoms and all PPV1 strains showed fluorescence in the assay. Comparing these techniques, 11 samples were positive in both tests and nPCR detected four additional samples. The concordance, sensitivity and specificity between the techniques were 98%, 73% and 100%, respectively. In conclusion, nPCR showed more sensitivity, however, real-time PCR could be a useful tool for diagnosis and quantification of PPV1 in serum samples and can be used for viremia studies, epidemiology and monitoring PPV1 infection in swine herds. The second study was performed in order to detect porcine circovirus 2 (PCV2), PPV1, porcine parvovirus 2, torque teno virus 1 and 2 (TTV1 and TTV2) and porcine hokovirus (PHoV) in different pooled tissues (lymph nodes, lungs, liver, spleen and kidneys) of piglets displaying Postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS) by PCR. All the samples were PCR positive for PCV2 and the other viruses were detected in all herds, with the exception of TTV1. The samples were positive for TTV2 (86.8%), PPV1 (81.6%), PPV2 (73.7%), PHoV (55.3%) and TTV1 (5.3%). These results showed that piglets displaying PMWS and infected with PCV2 presented co-infections with other virus, which could be involved in the syndrome. Since there are few data about genetic variability of PHoV, eight overlapping fragments of VP1/VP2 region of PHoV were amplified and. In phylogenetic analysis, Brazilian PHoV sequences were more closely related to European sequences. The results indicate that piglets displaying PMWS are PCV2 infected and can be co-infected with different parvovirus and circovirus species.