Estabelecimento de um novo método de diagnóstico molecular para mucopolissacaridose tipo I

Abstract

A mucopolissacaridose tipo I (MPS I) é uma doença genética autossômica recessiva, causada pela deficiência da enzima lisossomal α-L-iduronidase (IDUA), envolvida na degradação de dermatan e heparan sulfato. O acúmulo desses substratos nas células provoca inúmeras e variadas manifestações clínicas, acarretando diferentes formas da doença, as quais estão divididas de acordo com a sua gravidade: forma atenuada (Síndrome de Scheie – MPS I S), forma intermediária (Síndrome de Hurler-Scheie – MPS I SH) e forma grave (Síndrome de Hurler – MPS I H). O diagnóstico molecular precoce e preciso pode ser feito pela análise de DNA. Entretanto, como essa abordagem despende bastante tempo e recursos, procurou-se estabelecer uma estratégia mais eficiente de diagnóstico molecular. Inicialmente foi feita a comparação entre a metodologia tradicional e a análise por RNA através de levantamentos comparativos de tempo e custos de ambas as metodologias. A seguir, foi realizada a padronização e a validação dessa técnica. A padronização foi realizada em plasmídeo contendo cDNA de IDUA e a sua validação foi feita utilizando-se sangue e/ou fibroblastos de pacientes com diagnóstico molecular já estabelecido pela metodologia tradicional. Finalmente, foi sugerida uma nova abordagem otimizada de análise de DNA através da análise das freqüências de mutações descritas na literatura. O estudo do RNA pareceu, num primeiro momento, bastante vantajoso, sendo realizado em menos tempo e com custo reduzido para a genotipagem completa do gene. Para pesquisa das mutações comuns, a análise por RNA teve um custo mais alto, porém uma redução de 60% no tempo de processamento. Passou-se para a padronização da técnica, que foi realizada com sucesso. Entretanto, na etapa de validação observou-se que em pacientes com mutações sem sentido ou que alteram o sítio de splice, não são corretamente diagnosticados através dessa metodologia. Apenas as mutações com sentido trocado aparecem claramente, porém ainda assim pacientes heterozigotos compostos para essas mutações e uma mutação sem sentido são incorretamente diagnosticados como homozigotos, devido à falha de amplificação do alelo com mutação sem sentido. Como a abordagem proposta inicialmente não foi satisfatória, procurou-se uma estratégia otimizada de análise de DNA através do seqüenciamento direto de éxons com maior freqüência de mutações. Essa nova abordagem utilizando DNA ainda necessita ser validada em uma amostra de pacientes para que se possa conhecer o seu real impacto no tempo e custo do diagnóstico molecular de pacientes com MPS I.

Mucopolisaccharidosis type I (MPS I) is an autosomal recessive genetic disorder caused by the deficiency of the lysosomal enzyme α-L-iduronidase (IDUA), responsible for the degradation of dermatan and heparan sulfate. The storage of these undegraded or partially degraded substrates causes the various clinical manifestations of the disease that can be classified into three main forms: Scheie Syndrome (MPS I S), the attenuated form; Hurler- Scheie Syndrome (MPS I HS), the intermediate form; and Hurler Syndrome (MPS I H), the severe form. Early and precise molecular diagnosis can be performed by DNA analysis. However, as this methodology is time and resource-consuming, more efficient approaches are needed. Initially, a comparison between the traditional DNA analysis and RNA-based analysis was performed for each step of both techniques. Then, the RNA-based technique was set up using a plasmid with IDUA cDNA and validated on patients with molecular diagnosis already performed by DNA analysis. Finally, an optimized strategy for DNA-based analysis based on the mutation frequencies was proposed. In comparison with DNA-based analysis, RNA studies seem more advantageous, as it is less expensive and faster for whole gene sequencing. For the screening of common mutations it is more expensive but 60% less time-consuming. This technique was successfully set-up. However, at the validation step it was noticed that nonsense and splice site mutations are not correctly diagnosed by this methodology. Missense mutations can be clearly identified even though compound heterozygotes with nonsense mutations are wrongly diagnosed as homozygotes due to amplification failure of the nonsense carrying allele. As this approach was considered unsuitable for the analysis of MPS I patients, a new optimized strategy based on direct sequencing of selected exons was suggested. This approach still needs to be validated in a sample of patients so that its real impact on molecular diagnosis of MPS I can be established.