Identificação e caracterização de genes envolvidos na biossíntese de lipídios em Eugenia uniflora L. (Myrtaceae) e seu potencial envolvimento com mecanismos adaptativos na espécie

Abstract

Eugenia uniflora L., conhecida popularmente como pitanga, pitangueira ou cereja do Brasil, pertence à família Myrtaceae e sua distribuição ocorre ao longo dos domínios da Floresta Atlântica. E. uniflora é uma espécie versátil que ocorre em diferentes ambientes e apresenta variação no fenótipo, provavelmente como uma resposta ao ambiente. Essas características, e outras mais, a postulam ela como um bom modelo para estudos de variação adaptativa de populações naturais. Nesse sentido os lipídios podem ter um papel nos processos de adaptação das espécies por estarem envolvidos em uma extensa gama de reações metabólicas, exercendo papéis essenciais no desenvolvimento das plantas, como componentes das membranas celulares, armazenamento, moléculas sinalizadoras, entre outros. Os genes da rota da biossíntese de lipídios em plantas já foram reportados por participar em respostas a estresses ambientais. Entendendo que a adaptação depende do potencial das espécies de se adaptar e como a plasticidade fenotípica age a sinais ambientais conseguindo benefícios de ajuste para as espécies. Dessa forma, a presente dissertação teve como objetivo identificar e caracterizar genes envolvidos na rota de síntese de lipídios em Eugenia uniflora e verificar o seu potencial envolvimento em mecanismos adaptativos na espécie. Para isso, foram identificados e caracterizados os homólogos de GPAT em E. uniflora, utilizando os dados do transcriptoma através de diversas ferramentas de bioinformáticas como Blast2GO, Blastx ou ORFfinder e a base de dados Phytozome. Com as sequências obtidas foram realizadas análises filogenéticas, junto com os genes GPATs de Arabidopsis thaliana e Eucalyptus grandis já caracterizados, para a identificação dos ortólogos de GPATs e identificação dos domínios de proteínas conservadas. Além disso, também foram realizadas análises filogenéticas com as espécies do clado Rosidae que possuem genoma sequenciado para reconstruir as relações evolutivas dessa família gênica incluindo os genes de E. uniflora. Análises histoquímicas e morfológicas das folhas para a identificação de lipídios foram realizadas em indivíduos de duas populações. Para verificar o padrão de expressão dos genes GPAT nas populações de E. uniflora provenientes de distintos ambientes, foram realizadas análises de RT-qPCR. Sete genes GPATs putativos foram identificados em E. uniflora. As análises filogenéticas revelaram um ortólogo de GPAT1 (Euni_k21137491), dois ortólogos de GPAT2/3 (Euni_k21131380, Euni_k25280104), um ortólogo de GPAT 4/8 (Euni_k21284220), um ortólogo de GPAT 6 (Euni_k21135418) e dois ortólogos GPAT9 (Euni_k25121268, Euni_k25344309). Essas sequências mostraram relações evolutivas que resultaram de processos de duplicação e diversificação quando analisadas com genes ortólogos com espécies do clado Rosidae. Os primers desenhados para RT-qPCR foram testados em ambas as populações com fenótipos característicos dos ambientes provenientes, porém, os resultados da expressão ainda estão em andamento. As análises histoquímicas e morfológicas mostraram que a anatomia das folhas é semelhante entre as duas populações analisadas. Foi evidenciado a presença de lipídios (cutina) na cutícula da espécie sendo mais espessa nos indivíduos da população de Mata ciliar do que naqueles de restinga. Estes resultados possibilitaram explorar um caminho a mais para fazer inferências sobre a evolução adaptativa de populações naturais.

Eugenia uniflora L., popularly known as pitanga, pitangueira or cherry tree of Brazil, belongs to the family Myrtaceae and its distribution occurs along the Atlantic Forest domains. E. uniflora is a versatile species, that occurs in different environments and presents variation in the phenotype, probably as a response to the environment. These characteristics and others postulate as a model for studies of adaptive variation of natural populations. In this sense, lipids can be implicated in the adaptation processes of the species, since they are involved in a wide range of metabolic reactions, playing essential roles in the development of plants, such as: cell membrane components, storage, signaling molecules, among others. The genes of the lipid biosynthesis pathway in plants have been reported to participate in responses to environmental stresses. Understand that adaptation depends on the adaptive potential of the species and how phenotypic plasticity acts on the environmental signals, obtaining benefits for the species. Thus, the present dissertation aimed to identify and characterize genes involved in the route of lipid synthesis in Eugenia uniflora and to verify its potential involvement in adaptive mechanisms in the species. To that end, homologues of GPAT in E. uniflora were identified and characterized using transcriptome data through various bioinformatics tools such as Blast2GO, Blastx or ORFfinder and Phytozome database. With the sequences obtained, phylogenetic analysis were carried out, together with GPAT genes of Arabidopsis thaliana and Eucalyptus grandis already characterized, for the identification of orthologs of GPATs and identification of conserved protein domains. In addition, phylogenetic analyzes were also carried out with Rosidae clade species that have a sequenced genome to reconstruct the evolutionary relationships of this gene family including those of E. uniflora within the clade. Histochemical and morphological analysis of the leaves for the identification of lipids were performed in individuals from the same populations. To verify the expression pattern of GPAT genes in populations of E. uniflora from different environments, RT-qPCR analysis were performed. Seven putative GPAT genes were identified in E. uniflora. Phylogenetic analyzes revealed a GPAT ortholog of GPAT1 (Euni_k21137491), two GPAT2 / 3 orthologs (Euni_k21131380, Euni_k25280104), GPAT 4/8 ortholog (Euni_k21284220), GPAT6 ortholog (Euni_k21135418) and, two GPAT9 orthologs (Euni_k25121268, Euni_k25344309). These sequences showed evolutionary relationships that are of resulted in duplication and diversification processes when analyzed with orthologous genes of Rosidae species. The primers designed for RT-qPCR were tested in both populations with phenotypes characteristic of the coming environments, however, the expression results are still in progress. Histochemical and morphological analysis showed that the anatomy of the leaves is similar between the two populations analyzed. It was evidenced the presence of lipids (cutin) in the cuticle of the species being more present in the individuals of the Riparian forest population than in those of Restinga. These results enabled us to explore an additional way to infer about the adaptive evolution of natural populations.