Resistência a antimicrobianos e tolerância a metais pesados em Enterococcus sp. isolados de Leopardus geoffroyi do sul do Brasil: sentinela de poluição ambiental

Abstract

O bioma Pampa, localizado no sul do Brasil, é uma das seis regiões biogeográficas do país e abriga uma rica biodiversidade, incluindo espécies, como o gato-do-mato-grande (Leopardus geoffroyi). No entanto, a expansão agrícola, pecuária e urbanização têm ameaçado seu ecossistema, substituindo campos naturais por monoculturas e criações de animais, além de introduzir pesticidas e antibióticos prejudiciais. Bactérias do gênero Enterococcus são usadas como bioindicadores ambientais nesse bioma devido à sua ampla distribuição e a capacidade de adquirir e transferir genes que conferem redução na sensibilidade a compostos tóxicos. O estudo objetivou avaliar a resistência a antibióticos e metais pesados a partir de amostras orais e retais de gatos-do-mato-grande (L. geoffroyi). Foram utilizadas 23 amostras de 14 animais diferentes, provenientes das duas fontes de coleta. O isolamento foi realizado utilizando meios de cultura seletivos e a identificação das espécies foi realizada pela técnica de MALDI-TOF. O perfil de suscetibilidade frente a 12 antimicrobianos foi testado pelo método de disco difusão, de acordo com o CLSI. Cepas com susceptibilidade reduzida para tetraciclina e eritromicina foram avaliadas por PCR (reação em cadeia da polimerase) para a presença dos genes tetL e tetM; e msrC e ermB, respectivamente. O perfil de tolerância a metais pesados foi determinado pela concentração inibitória mínima (CIM), utilizando ágar suplementado com arsenato de sódio nas concentrações de 8 e 16 mM. As cepas positivas fenotipicamente no arsenato de sódio foram submetidas à PCR para detectar a presença de genes associados a tolerância ao arsênio, como arsA_I e arsA_II. Para análise da presença de genes associados a tolerância ao cobre, foi realizado PCR em todas as cepas com a finalidade de avaliar a presença do gene tcrB. No total, 141 enterococos foram isolados e identificados para a espécie. Foi realizado o perfil de suscetibilidade aos antimicrobianos em 111 amostras, e selecionadas 81 amostras para eliminar possíveis clones. Nessas amostras, E. faecium foi mais frequente (42%), seguido de E. faecalis (30%), E. cassseliflavus (11,1%), E. hirae (10%), E. durans (6,2%) e E.mundtii (1,2%). Quanto a suscetibilidade aos antimicrobianos, 80% das cepas apresentaram suscetibilidade reduzida a pelos menos um dos antimicrobianos, em que rifampicina foi o mais frequente com 44,4%, seguido por eritromicina (37%), ciprofloxacina (30,9%), tetraciclina (22,2%), norfloxacina (14,8%), vancomicina (12,3%), nitrofurantoína (7,4%), estreptomicina (3,7%), linezolida (2,5%) e ampicilina e cloranfenicol (1,2%). Dentre os 30 isolados resistentes à eritromicina, 43,3% possuíam o gene msrC e apenas 1,3% o gene ermB. Já para os 18 isolados resistentes à tetraciclina, 77% apresentou algum dos genes testados (tetL e tetM). Todas as 81 cepas foram analisadas quanto a concentração mínima inibitória (CIM) para o arsênio em duas concentrações, 8 e 16mM, em que 6 apresentaram um fenótipo resistente. As cepas positivas foram testadas para os genes asrA_I e arsA_II, porém não se obteve resultados positivos. Para análise da presença a análise da presença do gene tcrB, que confere resistência ao cobre, foi realizado PCR em todas as amostras, e o resultado foi negativo em todas. Em conclusão, as amostras avaliadas de gatos-do-mato-grande apresentam perfis de resistência a antimicrobianos e metais pesados, possivelmente provenientes do impacto das atividades humanas no ecossistema desses animais.

The Pampa biome, located in southern Brazil, is one of the country's six biogeographical regions and hosts a rich biodiversity, including species like Geoffroy's cat (Leopardus geoffroyi). However, agricultural expansion, livestock farming, and urbanization have threatened its ecosystem, replacing natural fields with monocultures and animal farming, and introducing harmful pesticides and antibiotics. Bacteria of the genus Enterococcus are used as environmental bioindicators in this biome due to their widespread presence and ability to acquire and transfer genes that confer reduced sensitivity to toxic compounds. This study aimed to assess antibiotic and heavy metal resistance from oral and rectal samples of Geoffroy's cats (L. geoffroyi). A total of 23 samples from 14 different animals, sourced from both collection points, were used. Isolation was performed using selective culture media, and species identification was conducted using the MALDI-TOF technique. Susceptibility profiles against 12 antimicrobials were tested using the disk diffusion method according to CLSI standards. Strains with reduced susceptibility to tetracycline and erythromycin were evaluated by PCR (polymerase chain reaction) for the presence of tetL and tetM genes, and msrC and ermB genes, respectively. The heavy metal tolerance profile was determined by minimum inhibitory concentration (MIC) using agar supplemented with sodium arsenate at concentrations of 8 and 16 mM. Strains phenotypically positive for sodium arsenate were subjected to PCR to detect the presence of genes associated with arsenic tolerance, such as arsA_I and arsA_II. To analyze the presence of genes associated with copper tolerance, PCR was performed on all strains to assess the presence of the tcrB gene. In total, 141 enterococci were isolated and identified to the species level. Antimicrobial susceptibility profiles were determined for 111 samples, and 81 samples were selected to eliminate possible clones. Among these samples, E. faecium was the most frequent (42%), followed by E. faecalis (30%), E. casseliflavus (11.1%), E. hirae (10%), E. durans (6.2%), and E. mundtii (1.2%). Regarding antimicrobial susceptibility, 80% of the strains showed reduced susceptibility to at least one of the antimicrobials, with rifampicin being the most frequent at 44.4%, followed by erythromycin (37%), ciprofloxacin (30.9%), tetracycline (22.2%), norfloxacin (14.8%), vancomycin (12.3%), nitrofurantoin (7.4%), streptomycin (3.7%), linezolid (2.5%), and ampicillin and chloramphenicol (1.2%). Among the 30 erythromycin-resistant isolates, 43.3% harbored the msrC gene, and only 1.3% the ermB gene. Of the 18 tetracycline-resistant isolates, 77% presented one of the tested genes (tetL and tetM). All 81 strains were analyzed for minimum inhibitory concentration (MIC) for arsenic at two concentrations, 8 and 16 mM, with six showing a resistant phenotype. The positive strains were tested for the arsA_I and arsA_II genes, but no positive results were obtained. To analyze the presence of the tcrB gene, which confers copper resistance, PCR was performed on all samples, and all tested negative. In conclusion, the samples from Geoffroy's cats exhibited antimicrobial and heavy metal resistance profiles, possibly due to the impact of human activities on these animals' ecosystems.