Utilização de ferramentas de bioinformática e de aprendizado de máquina na classificação das neoplasias de tireoide

Abstract

A compreensão dos mecanismos genéticos envolvidos na oncogênese das neoplasias de tireoide tem modificado nosso entendimento desse grupo de doenças. A análise molecular vem ganhando espaço, já sendo utilizada clinicamente na avaliação diagnóstica, prognóstica e terapêutica. Dessa forma, o manejo clínico das neoplasias de tireoide cada vez mais é guiado pelas alterações genéticas. Os estudos publicados até hoje tiveram como enfoque a busca por alterações na sequência do DNA, mas pouco se compreende sobre as alterações transcricionais e epigenéticas. O presente estudo objetiva avançar o conhecimento sobre as bases moleculares das neoplasias de tireoide a partir do estudo das alterações da metilação do DNA e da expressão gênica. Essa tese é composta por dois estudos: o primeiro dedicado à análise dos padrões de metilação do DNA encontrados nesse grupo de doenças; o segundo dedicado a investigar o impacto das mutações na região promotora do gene TERT sobre a expressão gênica. No primeiro estudo, foram analisados dados de metilação reunidos de seis estudos prévios, totalizando 810 amostras. Esses dados foram empregados para o treinamento de um modelo de aprendizado de máquina não supervisionado, sem qualquer dado clínico ou histopatológico. O modelo identificou que as amostras podiam ser divididas em três subtipos (clusters) com base exclusivamente no perfil de metilação. Esses subtipos estavam fortemente associados ao diagnóstico histopatológico (P<0.001) e foram, portanto, denominados normal-like, folicular-like e papilar-like. Adenomas e carcinomas foliculares ou oncocíticos compunham o subtipo folicular-like. Carcinomas papilíferos clássicos ou de células altas compunham o subtipo papilar-like. Os subtipos identificados estavam também associados aos drivers oncogênicos (P<0.001): 99% dos tumores com a mutação BRAF V600E eram papilar-like, enquanto 96% daqueles com mutações em RAS eram folicular-like. Por outro lado, amostras diagnosticadas como variante folicular do carcinoma papilífero acabaram dispersas em ambos os subtipos, demonstrando que esse tipo histológico não representa uma única doença, mas sim duas doenças distintas que compartilham características histopatológicas. Na segunda parte, foram empregados dados do The Cancer Genome Atlas para análise das alterações transcricionais associadas às mutações da região promotora do gene TERT (C228T e C250T). Sabe-se que essas mutações aumentam a expressão do gene TERT, conferindo maior agressividade e piores desfechos. Não se sabe, entretanto, se ambas as mutações são igualmente oncogênicas. Em nossa análise, observou-se que a a mutação C228T estava associada a um aumento de 15 vezes (P<0.001) nos níveis de RNAm do gene TERT, enquanto a mutação C250T estava associada a um aumenta de apenas 2 vezes (P=0.034). Clinicamente, a mutação C228T foi associada a idade avançada, invasão linfonodal e metástases. A sobrevida livre de metástases em 5 anos para pacientes com a mutação C228T foi de 79% em comparação a 98% para aqueles sem a mutação. Dessa forma, nossos dados sugerem que a mutação C228T possa conferir aos tumores maior agressividade, servindo como marcador prognóstico. Os dados apresentados aqui demonstram o potencial das ferramentas computacionais em alavancar nosso entendimento das bases moleculares das neoplasias de tireoide, oferecendo novos insights sobre a classificação e o prognóstico dessas doenças.

Understanding the genetic mechanisms involved in the oncogenesis of thyroid neoplasms has changed our comprehension of this group of diseases. Molecular analysis has been gaining ground and is already used clinically in diagnostic, prognostic, and therapeutic evaluation. Therefore, the clinical management of thyroid neoplasms is increasingly guided by genetic alterations. The studies published to date have focused on the search for changes in the DNA sequence, but little is known about transcriptional and epigenetic changes. The present study aims to advance knowledge about the molecular bases of thyroid neoplasms by studying changes in DNA methylation and gene expression. This thesis is composed of two studies: the first is dedicated to the analysis of DNA methylation patterns found in this group of diseases; the second is dedicated to investigating the impact of mutations in the promoter region of the TERT gene on gene expression. In the first study, methylation data gathered from six previous studies were analyzed, totaling 810 samples. These data were used to train an unsupervised machine learning model without any clinical or histopathological data. The model identified that samples could be divided into three subtypes (clusters) based solely on the methylation profile. These subtypes were strongly associated with histopathological diagnosis (P<0.001) and were therefore named normal-like, follicular-like, and papillary-like. Follicular or oncocytic adenomas and carcinomas comprised the follicular-like subtype. Classical papillary or tall cell carcinomas comprised the papillary-like subtype. The identified subtypes were also associated with oncogenic drivers (P<0.001): 99% of tumors with the BRAF V600E mutation were papillary-like, while 96% of those with RAS mutations were follicular-like. On the other hand, samples diagnosed as a follicular variant of papillary carcinoma ended up dispersed across both subtypes, demonstrating that this histological type does not represent a single disease but rather two distinct diseases that share histopathological characteristics. In the second part, data from The Cancer Genome Atlas were used to analyze transcriptional changes associated with mutations in the promoter region of the TERT gene (C228T and C250T). It is known that these mutations increase the expression of the TERT gene, resulting in greater aggressiveness and worse outcomes. It is not known, however, whether both mutations are equally oncogenic. In our analysis, it was observed that the C228T mutation was associated with a 15-fold increase (P<0.001) in TERT gene mRNA levels, while the C250T mutation was associated with an increase of only 2-fold (P=0.034). Clinically, the C228T mutation was associated with advanced age, lymph node invasion, and metastases. The 5-year metastasis-free survival for patients with the C228T mutation was 79% compared to 98% for those without the mutation. Therefore, our data suggest that the C228T mutation may confer tumors greater aggressiveness, serving as a prognostic marker. The data presented herein demonstrate the potential of computational tools in leveraging our understanding of the molecular basis of thyroid neoplasms, offering new insights into the classification and prognosis of these diseases.