Efeito genotóxico dos alcalóides beta-carbolínicos harmano e harmina em dois sistemas eucariotos : na levedura Saccharomyces cerevisiae e em fibroblastos de pulmão de hamster chinês

Abstract

Harmano e harmina, dois alcalóides β-carbolínicos encontrados em várias famílias de plantas, são conhecidos, principalmente, por apresentarem ações sobre os sistemas nervoso central, muscular e cardiovascular, causando alucinações, tremores, convulsões, hipotensão e bradicardia. São também agentes intercalantes entre as bases do DNA e inibidores enzimáticos, como as DNA topoisomerases e monoamino-oxidases. No presente estudo, foi investigada a citotoxicidade e genotoxicidade de harmano e harmina, em dois sistemas eucariotos, na levedura Saccharomyces cerevisiae e em culturas de fibroblastos de pulmão de hamster Chinês, células V79. Estes alcalóides apresentaram uma importante citotoxicidade em S. cerevisiae e em células V79, sendo este efeito mais pronunciado para a harmina. Na levedura, os dois alcalóides induziram resposta mutagênica fraca em células haplóides da levedura tratadas em fase exponencial na ausência de crescimento, para os locus his1-7 (mutação missense), lys1-1 (mutação forward) e hom3-10 (mutação frameshift). Harmano e harmina aumentaram as freqüências de recombinação (conversão gênica e crossing-over) em células diplóides apenas em condições de crescimento, porém somente para harmina estes resultados foram significantes. A sensibilidade pronunciada dos mutantes rad6Δ (defectivo na via mutagênica) e rad52-1 (deficiente em recombinação) ao harmano e harmina, permitiram inferir que estes alcalóides induzem, direta ou indiretamente, quebras simples e duplas nas cadeias de DNA. Já a sensibilidade mostrada pelos mutantes defectivos nas vias de reparação por excisão-ressíntese (rad3-e5, rad1Δ) aos alcalóides, indicaram que os mesmos também podem produzir adutos no DNA. As análises das interações entre os diferentes mutantes rad de S. cerevisiae, defectivos nas três principais vias de reparação, em relação aos danos no DNA produzidos por harmano e harmina, mostraram uma interação do tipo epistática entre os alelos mutantes rad3-e5 e rad52-1. Estes resultados sugerem que as lesões provocadas por esses alcalóides necessitam, para serem reparadas, da ação conjunta dos mecanismos de reparação por excisão-ressíntese e por recombinação. Entretanto, a interação não epistática observada entre os mutantes rad1Δ e rad6Δ indica que ambas as vias de reparação por excisão-ressíntese e sujeita à erros, atuam independentemente no reparo das lesões induzidas por estes alcalóides. Nas células V79, harmano e harmina usados em diferentes doses, induziram um aumento nas freqüências de aberrações, embora eles não tenham mostrado um claro efeito dose-resposta. Estes resultados indicaram que os dois compostos são agentes clastogênicos fracos. No ensaio Cometa, estes alcalóides apresentaram os índices e as freqüências de danos sobre o DNA significativamente aumentados em relação ao controle, em presença e ausência de um sistema de ativação metabólica. Estes resultados reforçam aqueles obtidos com as células de S. cerevisiae de que o harmano e a harmina geram quebras de cadeias simples e duplas no DNA.

Harman and harmine, two β-carboline alkaloids found in a number of plant families, are especially known for their action on the central nervous system (CNS), muscular and cardiovascular systems, causing hallucination, tremor, convulsion, hypo-tension and bradycardia. They are also intercalating agents between DNA and enzymatic inhibitors, like DNA topoisomerases and monoamino-oxydases. The cytotoxicity and genotoxicity of these alkaloids were studied in two eukaryotic systems, the yeast Saccharomyces cerevisiae and in Chinese hamster lung fibroblasts, V79 cells. An important degree of cytotoxicity was observed in both systems, more pronounced, however for harmine. ln yeast a weak mutagenic response was observed for haploid cells when treated in the exponential growth phase, in the absence of growing, for the loci his1-7 (missense mutation), lys1-1 (forward mutation) and hom3-10 (frameshifi mutation). Harman and harmine increased their recombinogenic freqüencies (gene conversion and crossingover) in diploid cells only in growing conditions. However, only for harmine significant results were found. The pronounced sensitivity of rad6Δ (defective in the mutagenic pathway) and rad52-1 (recombination deficient) to harman and harmine indicate that these alkaloids can, directly or indirectly, induce single and double DNA strand breaks. Mutants defective in the excision-resynthesis repair pathway (rad3-e5 and rad1 Δ) show sensitivity to the alkaloids, indicating that, in addition, they can induce DNA adducts. The analysis of the interactions between the different rad mutants of S. cerevisiae, defective in the three main repair pathways, concerning DNA damage caused by harman and harmine, show an epistatic type interaction between mutant alleles rad3-e5 and rad52-1. These results suggest that the lesions caused by these alkaloids, to be repaired, need the concurring action of excision-resynthesis and recombination mechanisms. However, the nonepistatic interaction observed between rad1Δ and rad6Δ mutants indicate that both excisionresynthesis and error prone repair pathways act in the repair of lesions induced by these alkaloids in an independent fashion. Though not showing a clear dose-response effect on V79 cells, different doses of harman and harmine induce an increase in the aberration frequency. This is an indication that both compounds are weak clastogenic agents. ln the Comet assay, in the presence and in the absence of a metabolic activation system, an increase of indices and frequencies DNA damage over the results of the control was shown. The above confirm and reinforce previous results in S. cerevisiae cells indicating that harman and harmine cause single and double DNA strand breaks.