Efeito periférico da isquemia cerebral transitória de radicais livres : um estudo da atividade das enzimas ATP difosfoidrolase (EC 3.6.1.5) e 5'nucleotidase (EC 3.1.3.5) de plaquetas de ratos adultos e do estresse oxidativo plasmático

Abstract

O nosso laboratório tem demonstrado que plaquetas de ratos expressam uma ectoenzima denominada ATP difosfoidrolase (EC 3.6.1.5) que hidrolisa ATP e ADP até AMP. Um possível papel fisiológico para esta enzima seria a participação em uma cadeia enzimática juntamente com uma 5'-nucleotidase (EC 3.1.3.5) para a hidrólise completa do ATP até adenosina na circulação. Assim, a ATP difosfoidrolase hidrolisa ATP e ADP até AMP e a 5'nucleotidase hidrolisa AMP até adenosina. Enquanto que o ATP e o ADP são descritos como nucleotídeos ativos nos vasos sanguíneos, sendo que o ADP é um fator de agregação plaquetária; a adenosina é um vasodilatador e inibidor da formação de microtrombos. Considerando que a ATP difosfoidrolase e a 5'-nucleotidase são importantes para a degradação de ATP, ADP e AMP e, possivelmente, para a formação de adenosina, a alteração destas atividades enzimáticas pode representar um fator que contribui para a injúria vascular em mecanismos patológicos associados aos radicais livres. Nós demonstramos o efeito in vitro de radicais livres nas atividades da ATP difosfoidrolase e da 5'-nucleotidase de plaquetas de ratos. As plaquetas foram expostas a um sistema que forma radicais livres sendo que estas enzimas foram inibidas. A inibição enzimática não aconteceu quando adicionamos glutationa (GSH) e cisteína no meio de incubação. Os resultados indicam que tióis plasmáticos de peso molecular baixo são importantes para a defesa contra a injúria causada pelos radicais livres sobre estas enzimas. Como a nossa proposta é que a ATP difosfoidrolase e a 5'-nucleotidase regulam a concentração de nucleotídeos no microambiente plaquetário, a nossa hipótese é que o metabolismo de nucleotídeos e, consequentemente, a formação de adenosina por estas enzimas podem ser alterados por radicais livres levando à formação de microtrombos cardíacos e cerebrais em doenças vasculares como a isquemia. Estudos têm mostrado que pacientes com doença cerebrovascular isquêmica apresentam formação de microtrombos periféricos. Além disso, a isquemia cerebral causa a morte de neurônios vulneráveis devido à excitoxicidade e ao estresse oxidativo, sendo que esta injúria é limitada quando o fenômeno de pré-condicionamento isquêmico é induzido. Muitos estudos têm sugerido que há a proteção contra a injúria neuronal após o pré-condicionamento porque um episódio de isquemia breve induz tolerância a episódios isquêmicos mais longos. Como o efeito protetor pelo pré-condicionamento contra a injúria tem sido atribuído à adenosina, é possível que as enzimas envolvidas na formação deste nucleosídeo no sistema nervoso e na circulação participem deste fenômeno como moduladores. A atividade de uma ATP difosfoidrolase de sinaptossomas de hipocampo de ratos tolerantes à isquemia cerebral foi demonstrada no nosso laboratório. No presente trabalho, nós investigamos a hipótese de que a isquemia cerebral transitória e o pré-condicionamento podem alterar o metabolismo de nucleotídeos na circulação periférica. Assim, os efeitos da isquemia cerebral, da reperfusão e do pré-condicionamento foram estudados nas atividades da ATP difosfoidrolase e da 5'-nucleotidase de plaquetas de ratos. Ratos adultos foram submetidos a um único episódio isquêmico (2 ou 10 min), ou a um episódio isquêmico duplo (pré-condicionamento isquêmico = 2+10 min) pelo método de oclusão dos quatro vasos. Ratos não pré-condicionados e pré-condicionados também foram submetidos à reperfusão. Os episódios isquêmicos de 2 ou 10 min inibiram a hidrólise do ATP e do ADP pela ATP difosfoidrolase de plaquetas. Por outro lado, a hidrólise do AMP pela 5'-nucleotidase aumentou depois de 2 min de isquemia, enquanto que com o episódio isquêmico de 10 min não houve efeito. O pré-condicionamento isquêmico ativou ambas as enzimas. Os efeitos da reperfusão foram diferentes para cada grupo experimental. As atividades enzimáticas retornaram aos níveis do controle no grupo que foi submetido a 2 min de isquemia e reperfusão. A atividade da ATP difosfoidrolase permaneceu inibida até 30 dias de reperfusão após 10 min de isquemia. Sessenta minutos e 1 dia de reperfusão após 10 min de isquemia inibiu a atividade da 5'- nucleotidase. Por outro lado, a enzima foi ativada após 10 min de isquemia seguidos de 2 e 5 dias de reperfusão, mas retornou aos níveis do controle depois de 10 e 30 dias. O pré-condicionamento isquêmico cancelou os efeitos dos 10 min de isquemia e da reperfusão sobre as atividades enzimáticas. Os resultados indicam que a isquemia cerebral e a reperfusão alteram a degradação de ATP, ADP e AMP por plaquetas e, provavelmente, a formação de adenosina na circulação. Além disso, o pré-condicionamento isquêmico ativa as enzimas levando a um possível aumento na degradação de ADP e formação de adenosina, e na consequente regulação da formação de microtrombos e do fornecimento de oxigênio ao tecido vascular. Embora a isquemia cerebral cause efeitos periféricos, ainda não foi definido se um provável estresse oxidativo está relacionado a estes efeitos. Entretanto, a ativação plaquetária na doença cardíaca isquêmica parece estar relacionada ao estresse oxidativo. No nosso estudo, sugerimos que a isquemia cerebral e a reperfusão podem causar, juntamente com o estresse oxidativo cerebral e a morte celular, um estresse oxidativo periférico que provavelmente está relacionado às alterações enzimáticas e à formação de microtrombos. Então, o nosso objetivo foi também estabelecer uma relação entre o pré-condicionamento isquêmico cerebral e uma possível proteção contra o estresse oxidativo periférico. Para avaliar esta possível relação, nós analisamos a emissão de quimioluminescência iniciada por tert-butil hidroperóxido e o conteúdo de tióis, como medidas do estresse oxidativo periférico, no plasma de ratos não pré-condicionados e pré-condicionados submetidos à isquemia cerebral produzida pelo método de oclusão dos quatro vasos. Os resultados mostram que 2 e 10 min de isquemia causam um aumento da quimioluminescência plasmática quando comparada aos ratos controle. No grupo que foi submetido a 2 min de isquemia, o efeito não permaneceu após a reperfusão. No grupo que foi submetido a 10 min de isquemia, o aumento permaneceu até 1 dia depois da reperfusão sendo que os valores retornaram aos níveis do controle após 2 dias. Entretanto, a quimioluminescência plasmática de ratos pré-condicionados à isquemia (2+10 min) e à reperfusão não foi diferente quando comparada ao controle. Quando nós analisamos os tióis, houve uma diminuição do conteúdo de tióis plasmáticos depois de 2, 10 min e 2+10 min de isquemia seguidos da reperfusão. Assim, a isquemia causa, juntamente com o estresse oxidativo cerebral e a morte celular, um estresse oxidativo periférico. Os ratos protegidos pelo pré-condicionamento contra a morte neuronal não apresentaram um aumento da quimioluminescência plasmática causado pela isquemia cerebral. Além disso, a diminuição de tióis plasmáticos em todos os grupos que foram submetidos à reperfusão indica que estes podem ser utilizados como antioxidantes. Concluindo, parece que as alterações nas atividades da ATP difosfoidrolase e da 5'-nucleotidase de plaquetas de ratos podem estar relacionadas a mecanismos patológicos associados aos radicais livres como a isquemia cerebral e a reperfusão.

Reports from our laboratory have shown that rat blood platelets contain an ecto-enzyme denominated ATP diphosphohydrolase (EC 3.6.1.5) that hydrolyzes ATP and ADP to AMP. The possible physiological role for this enzyme is to participate in an "enzyme chain" together with a 5'-nucleotidase (EC 3.1.3.5) for the complete hydrolysis of ATP to adenosine in the bloodstream. Thus, ATP diphosphohydrolase activity hydrolyzes ATP and ADP to AMP and 5' -nucleotidase hydrolyzes AMP to adenosina. Whereas ATP and ADP are known to be vasoactive and platelet active nucleotides, respectively, adenosine is described as a vasodilator and inhibitor of platelet aggregation. Considering that ATP diphosphohydrolase and 5'-nucleotidase are important in ATP, ADP and AMP degradation and, possibly, for adenosine generation, we have suggested that the alteration of these enzymatic activities may represent a factor contributing to vascular injury in pathologic free radical mechanisms. We have demonstrated the in vitro effects of free radicals on ATP diphosphohydrolase and 5'-nucleotidase activities from rat blood platelets. Platelets were exposed to an oxidant-generating system and these enzymes were inhibited. Enzymatic inhibition was prevented by glutathione (GSH) and cysteine. The results may indicate that reduced low-molecular-weight thiols from plasma are important for the defense against the oxidant injury by free radicals on the enzymes. Since we have proposed that ATP diphosphohydrolase and 5'-nucleotidase activities regulate the nucleotide concentration in the platelet microenvironment, our hypothesis is that the nucleotide metabolism and, consequently, adenosine generation by these enzymes may be affected by free radicals leading to facilitation of cardiac or cerebral microthrombus formation in vascular diseases such as ischemia. Studies have shown that patients with ischemic cerebrovascular disease present peripheral microthrombus formation. lt is also known that brain ischemia causes death of vulnerable neurons due to excitotoxic-triggered oxidative stress, but such injury is markedly limited when an ischemic preconditioning phenomenon is induced. Several studies have suggested that protection against neuronal injury after preconditioning occurs because a brief episode of ischemia induces tolerance to longer ischemic episodes. Since it has been postulated that the injury-limiting effect of preconditioning can be attributable to adenosine, it is possible that enzymes involved in the production of adenosine in the nervous system and in the circulation should participate or modulate such phenomenon. The activity of synaptosomal ATP diphosphohydrolase from the hippocampus of rats tolerant to brain ischemia has been demonstrated. ln the present study, we examined the hypothesis that transient brain ischemia and preconditioning may alter nucleotide peripheral metabolism. Thus, the effects of brain ischemia, reperfusion and preconditioning on rat blood platelet ATP diphosphohydrolase and 5'nucleotidase activities were evaluated. Adult rats were submitted to single ischemic episodes (2 or 10 min), or to a double ischemic episode (ischemic preconditioning -2+10 min) by the four-vessel occlusion method. Naive and preconditioned rats were also reperfused. Single ischemic episodes inhibited ATP and ADP hydrolysis by platelet ATP diphosphohydrolase. On the other hand, AMP hydrolysis by 5-nucleotidase was increased after 2 min ischemia, whereas the 10 min ischemic event had no effect. lschemic preconditioning caused activation of both enzymes. The effects of reperfusion were distinct for each experimental group. Enzyme activities returned to control leveis in the 2 min ischemic group. The decrease in ATP diphosphohydrolase activity was maintained up to 30 days of reperfusion after 10 min ischemia. Sixty min and 1 day of reperfusion after 10 min ischemia inhibited 5'-nucleotidase activity. On the other hand, the enzyme activity was activated after 10 min ischemia followed by 2 and 5 days of reperfusion, but returned to control levels after 10 and 30 days. Interestingly, ischemic preconditioning cancelled the effects of 10 min ischemia and reperfusion on the enzymatic activities. The results indicate that brain ischemia alter ATP, AOP and AMP degradation from platelets and probably the generation of adenosine in the circulation. Furthermore, ischemic preconditioning activates the enzymes leading to a possible increase in ADP degradation and adenosine formation, and the consequent regulation of microthrombus formation and vascular tissue oxygen supply. Although it has been shown that brain ischemia induces peripheral effects, it has not been defined if a probable oxidative stress is related to these effects. However, it has been suggested that in ischemic heart disease platelet activation is related to oxidative stress. ln our study, we have suggested that cerebral ischemia and reperfusion may cause, along with brain oxidative stress and cell death, a peripheral oxidative stress that probably is related to enzymatic alterations and microthrombus formation. Thus, our objective was also to establish a relationship between brain ischemic preconditioning and a possible protection against the state of peripheral oxidative stress. To evaluate this possible relationship, we measured the tert-butyl hydroperoxide-initiated chemiluminescence emission and thiol content, as measures of peripheral oxidative stress, in plasma of naive and preconditioned rats submitted to brain ischemia produced by the 4-vessel occlusion method. Results show that both 2 and 10 min of ischemia cause an increase of plasma chemiluminescence when compared to control rats. ln the 2 min ischemic group, the effect was not present after reperfusion. ln the 10 min ischemic group, the increase was present up to 1 day after recirculation and values returned to control levels after 2 days. However, rats preconditioned to ischemia (2+10 min) and reperfusion showed no differences in plasma chemiluminescence when compared to controls. When we analyzed thiols, there was a decrease of plasma thiol content after 2, 10 min and 2+10 min of ischemia followed by reperfusion when compared to controls. Thus, ischemia causes, along with brain oxidative stress and cell death, a peripheral oxidative stress. Rats protected against neuronal death by preconditioning do not exhibit ischemia-induced increases in plasma chemiluminescence. Furthermore, the decrease in thiol content in all reperfused groups indicates its antioxidant capacity. ln conclusion, it seems that changes in ATP diphosphohydrolase and 5'-nucleotidase activities from rat blood platelets may be related to pathologic free radical mechanisms such as cerebral ischemia-reperfusion.