Aperfeicoamento de método de diagnóstico para tuberculose e caracterização de Mycobacterium tuberculosis por RFLP

Abstract

A tuberculose é ainda uma das mais importantes doenças infecciosas no mundo, particularmente em países em desenvolvimento. No Brasil, ocorrem 10 casos novos por hora e morrem 14 doentes por dia. O controle da tuberculose tem sido realizado, principalmente, na identificação e tratamento de pessoas com tuberculose ativa. Os métodos tradicionais para identificar a doença são ainda pouco sensíveis ou muito demorados. A detecção de M. tuberculosis em amostras clínicas por "polymerase chain reaction" (PCR) tem sido descrita. Entretanto, apesar do sucesso do PCR para detectar DNA de M. tuberculosis diretamente em amostras clínicas, a implantação do método na rotina de laboratórios de saúde pública não tem sido incorporada facilmente. Problemas como contaminação, inibição, métodos de extração de DNA trabalhosos e custo elevado não foram ainda totalmente resolvidos. Os métodos que permitem a caracterização de isolados de M. tuberculosis são importantes para, através de investigações epidemiológicas, correlacionar doentes e localizar fontes de infecção, possibilitando a interrupção da transmissão. Recentemente, muitos métodos foram descritos para detectar polimorfismo em diferentes regiões do DNA. No entanto, somente a técnica de "restriction fragment length polymorphism" (RFLP) tem demonstrado adequada sensibilidade e reprodutibilidade. Este trabalho foi desenvolvido com o objetivo de estabelecer métodos para diagnosticar a tuberculose e caracterizar isolados de M. tuberculosis. O método de diagnóstico escolhido foi baseado na técnica de PCR por ser de execução rápida e permitir detectar baixo número de microorganismos. Como a sensibilidade do PCR é bastante dependente de uma preparação da amostra antes da amplificação, esforços foram feitos, principalmente, para estabelecer um método para purificar o DNA de M. tuberculosis proveniente da amostra clínica. Uma etapa de purificação de DNA com pó de vidro foi incluída ao método de fervura. Várias amostras foram então testadas (incluindo escarro, líquor, sangue, soro e urina). Os resultados foram comparados com os diagnósticos clínico e bacteriológico dos pacientes. Também foram analisados por RFLP associado ao IS6110 e IS1081, vários DNAs de M. tuberculosis isolados no Rio Grande do Sul com o objetivo de adaptar a técnica e verificar a capacidade de distinguir os isolados. Apesar das análises por RFLP mostrarem excelente capacidade de diferenciar e correlacionar os isolados, a técnica é trabalhosa, demorada e de custo elevado, dificultando sua utilização. Assim, análises de DNA de M. tuberculosis foram realizadas por "spoligotyping" que detecta polimorfismo na região DR utilizando amplificação por PCR. Ambos os métodos foram comparados e apesar da técnica de "spoligotyping" ser mais simples e rápida que RFLP, o grau de diferenciação obtido dos isolados foi menor para espécies com alto número de cópias de IS6110. No entanto, a metodologia mostrou potencial para sua utilização em rotinas de laboratórios se mais oligonucleotídeos forem incluídos no teste.

Tuberculosis is one of the most important infectious diseases in the world, particularly in developing countries. ln Brazil, ten new cases occur every hour and fourteen patients die per day. The control of tuberculosis has been mainly based on the identification and treatment of the patients with active disease. The traditional methods to identify the infection are still of low sensitivity or time consuming. The detection of M. tuberculosis species in clinical samples by polymerase chain reaction (PCR) has been reported. However, despite the success of PCR to detect M. tuberculosis DNA directly in clinical specimens, the method has not been easily incorporated to the routine procedure in public health laboratories. Problems such as contamination, inhibition, laborius and expensive methods are not completely solved. The methods to identify M. tuberculosis isolates are very important, since they can be used in epidemiological studies, giving information about possible correlations of TB patients allowing the interruption of the transmission chain. Recently, several methods for the identification and strain relationship among isolates of M. tuberculosis have been described, some methods are based on the analysis of DNA digested by restriction enzymes (like restriction fragment length polymorphism, RFLP) and methods based on DNA amplification. However, the only system described so far with the required reproducibility and sensitivity is the RFLP method. This work was developed aiming to establish methods to detect tuberculosis in different clinical samples and to characterize isolates of M. tuberculosis. The method for diagnosis based on the PCR technique was chosen because it is simple and allows the detection of a low number of microorganisms. Since the sensitivity of PCR is quite dependent of an efficient preparation of specimen before amplification, efforts were mainly done to establish a method for purification of DNA from samples. We established a modification of the heating method for releasing DNA. The inclusion of a single glass matrix purification step improved the amplification of the M. tuberculosis DNA in clinical samples (including sputum, cerebrospinal fluid, blood, serum and urine). The results were compared to clinical and bacteriological diagnosis. In addition, we analysed M. tuberculosis isolates from Rio Grande do Sul by RFLP associated to the insertion IS6110 and IS1081, to optimise the method and verify its sensitivity for the detection of DNA polymorphism. Although RFLP analysis sequences offers an accurate avaliation of the relationships among isolates, its use by laboratories in developing countries is very difficult because it is laborious, time consuming and expensive. For this reason we have characterized the isolates by spoligotyping which detects polymorphism by PCR amplification of the DR region. Both methods were compared showing that the degree differentiation of M. tuberculosis by spoligotyping was less sensitivity to detect strains with high number of IS6110 copies. However, the methodology has a good potential to be used in routine procedures, if more oligonucleotides are included in the test.