Caracterização antigênica e molecular de amostras brasileiras do vírus da raiva e construção de um herpesvírus bovino tipo 1 (BHV-1) contendo gene que codifica a glicoproteína do vírus da raiva

Abstract

O vírus da Raiva foi considerado durante muito tempo como sendo muito estável antigenicamente. Entretanto, nos últimos anos, diversos trabalhos de caracterização de isolados do vírus da Raiva, realizados em várias partes do mundo, demonstraram diferenças entre as amostras de vírus isoladas de diferentes espécies animais. Estas diferenças ocorrem principalmente entre amostras do vírus isoladas de hospedeiros terrestres e aéreos (morcegos). Este trabalho teve como objetivos o estudo de características antigênicas e genômicas de amostras brasileiras do vírus da Raiva e o desenvolvimento de uma vacina contra a Raiva, produzida a partir de um vetor viral. Setenta e oito amostras de vírus rábico, obtidas de diferentes espécies e oriundas de vários estados brasileiros foram submetidas a um perfil de reatividade com um painel de anticorpos monoclonais (Mabs) dirigidos contra antígenos dos Lyssavirus. Posteriormente, essas amostras foram submetidas a análise genômica, envolvendo a análise de restrição genômica (REA) da seqüência inteira do gene que codifica a nucleoproteína viral (N; 1,5 kb) amplificado pela reação em cadeia da polimerase (PCR). A combinação da caracterização antigênica e REAs permitiu a diferenciação das amostras de acordo com a espécie de origem, independente da distribuição geográfica. O seqüenciamento de 225 nucleotídeos do gene N (nucleotídeos 140-364), de sete amostras do vírus, consideradas representativas das amostras analisadas, confirmou as diferenças identificadas através da análise antigênica e REA. O seqüenciamento também permitiu um refinamento na caracterização de amostras isoladas de morcegos, revelando diferenças entre amostras isoladas de espécies hematófagas e não hematófagas, sugerindo que as amostras virais de morcegos não hematófagos vem apresentando evolução adaptativa distinta das amostras de morcegos hematófagos. A segunda parte deste estudo teve como objetivo o desenvolvimento de um antígeno com potencial para o desenvolvimento de uma vacina bivalente contra a Raiva e contra o Herpesvírus Bovino Tipo 1 (BHV-1). Para isto, foi construído um vírus recombinante utilizando como vetor uma amostra autóctone de BHV-1, onde foi inserido, no locus do gene que codifica a glicoproteína E (gE) viral, o gene que codifica a glicoproteína (G) do vírus rábico. A estratégia escolhida para a construção do recombinante incluiu a remoção de potenciais sítios de splicing do gene G, com o objetivo de propiciar a transcrição e tradução adequada do mesmo nas células infectadas pelo recombinante. A expressão da proteína G do vírus da Raiva foi detectada em células eucarióticas transfectadas com DNA plasmideal contendo o gene G do vírus da Raiva e também após a co-transfecção, em células EBTr, do DNA do BHV-1 wild-type e do fragmento de recombinação contendo o gene G do vírus da Raiva. O vírus recombinante (BHV-gE/ Raiva G) produzido está sendo isolado para posteriormente ser caracterizado e avaliado experimentalmente.

Rabies vírus has been considered very stable antigenically. However, in last years, differences among isolates from different species have been found in many regions of the world. These differences have been mainly found among rabies virus isolates from terrestrial and aerial hosts (bats). This present work focused on the study of antigenic and genomic characteristics of Brazilian rabies vírus isolates and the development of a vaccine against rabies virus using a viral vector. For this purpose, seventy-eight rabies virus isolates from distinct host species and from different geographic areas were analysed. Samples were submitted to antigenic analysis with a panel of monoclonal antibodies (Mabs) directed to Lyssavirus antigens, to restriction endonuclease analysis of RT-PCR products and partial sequencing of 225 bp on the terminal region of the N gene of rabies virus. The combination of these techniques allowed to differentiate rabies isolates according to species of origin and not according to geographic distribution of isolates. Moreover, sequencing of the N gene fragment allowed to distinguish rabies vírus isolates of haematophagous bat origin from those of non-haematophagous bats. Such findings suggest that the variants isolated from non-haematophagous bats have evolved independently of vampire bat viruses. Another part of the study aimed the development of an antigen with potential to be used as a bivalent vaccine against rabies vírus as well as against bovine herpesvirus type I (BHV-1). For that, a recombinant vírus was constructed using, as a vector, an autochtonous strain of BHV-1 in which a gene coding for the glycoprotein (G) of rabies vírus was inserted on gE locus of BHV-1. The strategy for the construction of such recombincmt includes the design of a synthetic glycoprotein gene, based on a sequence from rabies virus isolate of haematophagous bat origin, from which, as many as possible, splicing sites were removed in order to avoid the cleavage of the rabies G gene within the nucleus of recombinant BHV-1 infected cells. The G protein expression was detected in eucariotic cells transfected with plasmid DNA containing rabies G gene and after co-transfection of EBTR cells with the wild-type BHV-1 DNA and the recombination fragment containing rabies G gene. The recombinant virus (BHV-gE-1 rabies G) was constructed and is now in process of isolation, in order to proceed its experimental evaluation.