Construção de um vetor para terapia gênica baseado no bloqueio da síntese protéica devido a expressão de elF2 beta truncado

Abstract

A terapia gênica tem sido explorada como tratamento para uma grande variedade de distúrbios genéticos, diminuição da progressão de tumores e no combate a infecções virais e doenças neurodegenerativas. A síntese protéica é um processo essencial à célula que envolve centenas de macromoléculas. A ausência ou a perturbação da função de qualquer um dos componentes no sistema de tradução pode comprometer o funcionamento celular. O fator eucariótico 2 de iniciação da tradução (eIF2) apresenta um papel-chave no processo de tradução do mRNA e na sua regulação, promovendo a ligação do Met-tRNAi à subunidade ribossomal 40S e fazendo a seleção do códon AUG no mRNA para início da tradução. O eIF2 é um heterotrímero formado pelas subunidades a, e g. A porção amino-terminal de eIF2b possui um domínio bastante marcante composto por três blocos de seis a oito resíduos de lisina altamente conservados, que são responsáveis pela ligação do eIF2 ao mRNA e a outros dois fatores de iniciação, eIF5 e eIF2B. Estudos anteriores mostraram inibção do crescimento em Saccharomyces cerevisiae pela expressão de eIF2b desprovido dos blocos de lisinas, mesmo na presença da forma celular selavagem dessa proteína (Laurino JP, dados não publicados). Esse resultado sugere o gene de eIF2b humano como um forte candidato à terapia gênica direcionada principalmente ao tratamento de tumores. O objetivo do trabalho foi construir plasmídeos contendo fragmentos truncados de eIF2 beta humano (em relação à presença ou ausência dos três blocos de lisina) sob controle de um forte promotor humano. Essas construções poderiam ser capazes de expressar essas proteínas truncadas de maneira eficiente, competindo com eIF2b selvagem em células humanas. Esse trabalho resultou na construção de quatro plasmídeos de expressão induzida por tetraciclina em eucariotos contendo os seguintes diferentes fragmentos sob controle do forte promotor de citomegalovírus (CMV): 1) eIF2b humano selvagem; 2) eIF2b humano desprovido dos três blocos de lisinas; 3) porção 13 amino-terminal de eIF2b humano brangendo os blocos de lisinas); 4) porção carboxi-terminal de eIF2b (não abrangendo os blocos de lisinas). Também se obteve como resultado mais duas construções: um plasmídeo expressando o gene de uma variante da proteína verde fluorescente (EGFP) sob controle do promotor de CMV e o gene do repressor de tetraciclina, para ser usado na transfecção de células humanas, concomitantemente, com uma das quatro construções referidas acima. Um outro plasmídeo, contendo o cDNA de eIF2b humano fusionado a um “tag” de biotina para sua expressão em Escherichia coli também foi construído. É possível que a expressão de formas truncadas de eIF2b possa ser utilizada como uma nova estratégia de terapia gênica anti-proliferação celular direcionada, principalmente, a células tumorais.

Gene therapy has been extensively investigated as a treatment for a wide variety of genetic disorders, decreasing of tumor progression, fighting viral infections and neurodegenerative diseases. Protein synthesis is an essential process to the cell, involving hundreds of macromolecules. The absence or alteration of function of any of the components of the translation system may compromise cell biology. Eukaryotic initiation factor 2 (eIF2) plays a key role on mRNA translation and its regulation, promoting binding of Met-tRNAi to the 40S ribosomal subunit and selecting s AUG codon in mRNA to translation initiation. eIF2 is a heterotrimer consisted of a, and g subunits. The aminoterminal region of eIF2b presents three lysine–rich segments containing 6 to 8 conserved lysine residues, which are responsible for binding of eIF2 to mRNA and to two other initiation factors: eIF5 and eIF2 . Previously results showed growth inhibiton in S. cerevisiae by expression of eIF2 with deleted lysine-rich segments, even in the presence of wild type eIF2 (Laurino JP, unpublished data). This finding suggests human eIF2 gene as a strong candidate for gene therapy, especially for tumor treatment. The aim of this study was to build plasmids containing mutated human eIF2 fragments (in relation to the presence or absence of the three lysine–rich segments), under control of a strong human promoter. These constructions could be able to express efficiently truncated eIF2 , competing with the wild eIF2 in human cells. For this purpose we built four tetracycline-induced expression plasmids in eukaryotes containing the following different fragments under control of the strong cytomegalovirus promoter (CMV): (1) the wild human eIF2 ; (2) the human eIF2 with deletion of three lysine–rich segments; (3) the amino-terminal portion of the human eIF2 containing three lysine-rich segments); (4) the carboxy-terminal portion of the 15 eIF2 (not containing three lysine-rich segments). We also constructed an expression plasmid containing tetracycline repressor gene and the gene of a green fluorescent protein variant (EGFP), controlled by CMV promoter. This plasmid can be used in transfection, concomitantly with one of the four constructions above mentioned. Another plasmid containing human eIF2 cDNA fusioned with a biotin-tag was constructed for expression in Escherichia coli. The expression of truncated human eIF2 protein forms could be used as a new strategy for gene therapy against cell proliferation, especially for tumor cells.