Análise da infecção in vitro e in vivo pelo Zika vírus no desenvolvimento de doenças cardiovasculares

Abstract

O Zika vírus (ZIKV) é conhecido por sua relação com complicações neurológicas, entretanto, estudos recentes também indicam que o ZIKV pode estar relacionado com o desenvolvimento de doenças cardiovasculares. Diante do aumento do número de relatos de casos de pacientes com complicações cardíacas após a infecção por ZIKV, se faz necessário estudos experimentais que busquem investigar esta associação. O objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos da infecção pelo ZIKV, in vitro, in vivo e in silico no desenvolvimento de doenças cardiovasculares. No estudo in vitro células H9c2 e A7r5 foram infectadas com o ZIKV de origem brasileira, utilizando multiplicidade de infecção (MOI) de 1; 0,1 e 0,01. As células infectadas foram observadas diariamente em microscópio óptico para verificação de efeito citopático (ECP). A cada 24h pós-infecção, durante um período de 4 dias, os cultivos infectados foram congelados, descongelados e aliquotados para posterior análise de genoma viral por qPCR e titulação viral. Para análise da viabilidade celular foi realizado o teste de atividade da lactato desidrogenase (LDH) e para estresse oxidativo foi analisada a proteína carbonil e redução de NBT. No experimento in vivo, camundongos fêmeas FVB/N (n=8), com idade de 60 dias, foram inoculados com 1x10⁵ UFP de ZIKV via intravenosa. Após 4 dias de infecção, foi realizada coleta de sangue e tecido cardíaco para análise de troponina T, atividade enzimática de fatores de coagulação, aminopeptidases e análise de estresse oxidativo. Foi realizada análise estatística univariada através do teste t e ANOVA. Ainda, correlacionamos genes listados na Zika Virus Infection Database (ZIKAVID) aos genes ligados ao estresse oxidativo da Mouse Genome Database (MGD) a fim de verificar associação entre doenças cardíacas, estresse oxidativo e o ZIKV. As linhagens celulares apresentaram ECP característico de infecção viral e o RNA genômico foi detectado em todos os períodos analisados. A linhagem H9c2 produziu uma quantidade de vírus significativamente superior à A7r5 e analisando o estresse oxidativo após infecção, verifica-se que os níveis médios de conteúdo carbonil foram significativamente maiores nas linhagens celulares infectadas. Já in vivo, nas fêmeas infectadas houve um aumento significativo de troponina T quando comparado ao grupo controle. Ainda, observou-se um aumento significativo da atividade de enzimas fibrinolíticas e níveis elevados das aminopeptidases. Também, os resultados demonstraram alto índice de estresse oxidativo no tecido cardíaco de camundongos infectados. Conclui-se que além da suscetibilidade celular ao ZIKV, animais imunocompetentes infectados apresentam marcador de injúria celular elevado com ativação de enzimas pró-coagulantes e uma regulação negativa da fibrinólise, o que provavelmente indica um estado pró- trombótico nesses animais, evidenciando uma associação entre o vírus e complicações cardíacas.

The Zika virus (ZIKV) is known for its relationship with neurological complications, however, recent studies also indicate that ZIKV may be related to the development of cardiovascular diseases. In view of the increasing number of case reports of patients with cardiac complications after ZIKV infection, experimental studies are needed to investigate this association. The aim of this study was to evaluate the effects of ZIKV infection, in vitro, in vivo and in silico on the development of cardiovascular diseases. In the in vitro study, H9c2 and A7r5 cells were infected with ZIKV of brazilian origin, using a multiplicity of infection (MOI) of 1; 0.1 and 0.01. Infected cells were observed daily under an optical microscope to verify the cytopathic effect (CPE). Every 24h post-infection, during a period of 4 days, the infected cultures were frozen, thawed and aliquoted for subsequent analysis of the viral genome by qPCR and viral titration. For cell viability analysis, the lactate dehydrogenase (LDH) activity test was performed and for oxidative stress, carbonyl protein and NBT reduction were analyzed. In the in vivo experiment, female FVB/N mice (n=8), aged 60 days, were inoculated with 1x10⁵ PFU of ZIKV intravenously. After 4 days of infection, blood and cardiac tissue were collected for analysis of troponin T, enzymatic activity of clotting factors, aminopeptidases, analysis of oxidative stress. Univariate statistical analysis was performed using the t test and ANOVA. Furthermore, we correlated genes listed in the Zika Virus Infection Database (ZIKAVID) with genes linked to oxidative stress from the Mouse Genome Database (MGD) in order to verify an association between heart disease, oxidative stress and ZIKV. The cell lines showed CPE characteristic of viral infection and genomic RNA was detected in all analyzes periods. The H9c2 cells produced a significantly higher amount of virus than A7r5 and analyzing the oxidative stress after infection, it appears that the average levels of carbonyl content were significantly higher in the infected cell lines. In vivo, in infected females, there was a significant increase in troponin T when compared to the control group. Furthermore, there was a significant increase in the activity of fibrinolytic enzymes and high levels of aminopeptidases. Also, the results showed a high rate of oxidative stress in the heart tissue of infected mice. It is concluded that in addition to cellular susceptibility to ZIKV, infected immunocompetent animals have a high marker of cell injury with activation of procoagulant enzymes and a negative regulation of fibrinolysis, which probably indicates a prothrombotic state in these animals, evidencing an association between the virus and heart complications.