Clonagem, expressão e produção de dna polimerase de alta fidelidade de pyrococcus furiosus

Abstract

A reação em cadeia da DNA polimerase (PCR) é uma das técnicas de biologia molecular mais importantes da atualidade e amplamente utilizada em laboratórios clínicos e de pesquisa. Considerando a alta fidelidade requerida para algumas PCRs e o alto custo para a aquisição de DNA polimerases termoestáveis de alta fidelidade, o objetivo que norteou o desenvolvimento deste trabalho foi a clonagem, a expressão e a produção da proteína Pfu DNA polimerase para fins comerciais. A sequência completa do gene de Pyrococcus furiosus codificadora da Pfu DNA polimerase foi projetada e adaptada para a frequência de códons de Escherichia coli. A síntese da sequência gênica foi solicitada à empresa GenScript. A sequência recombinante, denominada rPfu, foi transferida do vetor de clonagem pUC57 da GenScript aos plasmídeos de expressão de E. coli pET-23a(+) e pGEX-4T-1. Células competentes de E. coli da linhagem BL21(DE3)pLysS foram transformadas com os plasmídeos de expressão por eletroporação. A análise de extratos proteicos totais de ambas as linhagens recombinantes em gel de poliacrilamida mostrou a eficiência dos testes de expressão. Utilizando-se o vetor pET-23a(+)-rPfu, obteve-se a expressão de uma proteína de aproximadamente 95 kDa, sendo que 5 kDa correspondem à cauda de histidinas originária do plasmídeo. A rPfu produzida a partir da expressão de pET-23a(+)-rPfu foi purificada utilizando-se o método de cromatografia imobilizada de íons metálicos (IMAC). Utilizando-se o vetor pGEX-4T-1-rPfu, obteve-se a expressão de uma proteína de aproximadamente 116 kDa, sendo 26 kDa referentes à proteína de fusão, glutationa S-transferase (GST) originária do plasmídeo. Procedimentos de purificação desta versão da rPfu, de avaliação da atividade enzimática e de scale-up para a produção de quantidades comerciais da proteínas estão sendo conduzidos.