Desenvolvimento in vitro de vetores hipermodularizados para a edição de genes e genomas de leveduras de interesse industrial

Abstract

As tecnologias de edição gênica baseadas no uso das nucleases associadas com repetições palindrômicas curtas agrupadas e regularmente interespaçadas (CRISPR-Cas) vem ganhando destaque por serem consideradas eficientes, simples e de baixo custo para aplicações em diferentes campos de pesquisas, incluindo biotecnologia de microrganismos, especialmente para leveduras de uso industrial. Neste sentido, o uso da Biologia Sintética (BioSin) facilita a criação de ferramentas moleculares que modularizam, padronizam e ortogonalizam a CRISPR-Cas, possibilitando adequar a ferramenta para quaisquer contextos biológicos, aumentando a taxa de eficiência de protocolos de edição gênica. Sendo assim, a técnica de Golden Gate, que faz uso de enzimas de restrição do tipo IIS para a concatenação de partes de DNA, permite que vetores para a edição gênica sejam gerados de forma rápida e em um único passo reacional, acelerando consideravelmente a geração de protótipos de vetores e de chassis de leveduras industriais editadas. Sendo assim, o propósito deste projeto foi gerar um vetor hipermodularizado para a inserção de diferentes sequencias codificantes para Cas9/Cas12a, marcas de seleção de transformantes de leveduras e origens de replicação de DNA de leveduras. O vetor base hipermodularizado pModCas2C foi aplicado para a criação de dois vetores bi-funcionais em uma única reação do tipo Golden Gate, um contendo a sequência codificante para Cas9 e outro a sequencia para Cas12a, além de uma marca de prototrofia para uracila e a origem de replicação epissomal 2 micra de Saccharomyces cerevisiae (vetores pCas9U2micra e pCas12U2micra, respectivamente). Para acelerar a prototipagem e a seleção do pCas9U2micra, foi desenvolvido um pipeline de transformação de S. cerevisiae seguido do uso de Escherichia coli associado à técnica de PCR de colônias do tipo multiplex. A aplicação deste pipeline possibilitou obter o vetor pCas9U2micra de forma rápida. Porém, tanto a técnica de Golden Gate quanto o pipeline de prototipagem vetorial usados neste projeto se mostraram de baixa eficiência, abrindo espaço para otimizações futuras destas técnicas visando a obtenção de vetores de edição gênica de forma rápida e em grande escala.

Gene editing technologies based on the use of nucleases associated with clustered and regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR-Cas) have been gaining attention because they are considered efficient, simple, and inexpensive for applications in different fields of research, including industrial yeasts. Synthetic Biology (SynBio) facilitates the creation of molecular tools that modularize, standardize, and orthogonalize CRISPR-Cas, making it possible to adapt the tool to any biological context, increasing the efficiency rate of gene editing protocols. For example, the Golden Gate technique uses type IIS restriction enzymes to concatenate parts of the DNA, allowing the generation of vectors quickly and in a single reaction step, considerably accelerating the generation of industrial yeast vectors and edited yeast chassis prototypes. Therefore, this project aimed to generate a hypermodularized vector for inserting different coding sequences for Cas9/Cas12a, yeast transformant selection marks, and yeast DNA replication origins based on the Golden Gate technique. The hypermodularized vector pModCas2C was used to create two shuttle vectors in a single Golden Gate reaction, one containing the coding sequence for Cas9 and the other the sequence for Cas12a, in addition to a prototrophy marker for uracil and the 2 micra DNA replication origin of Saccharomyces cerevisiae (pCas9U2micra and pCas12U2micra vectors, respectively). To accelerate the prototyping and selection of pCas9U2micra, an S. cerevisiae transformation pipeline was developed, followed by multiplex-type Escherichia coli colony PCR. The application of this pipeline made it possible to obtain the pCas9U2micra vector quickly. However, the Golden Gate technique and the vector prototyping pipeline used in this project proved inefficient, opening space for future optimization of these techniques to obtain gene-editing vectors quickly and on a large scale.