Pseudomonas aeruginosa isoladas de pacientes portadores e não portadores de fibrose cística : avaliação da formação de biofilme, quorum-sensing, auxotrofia e resistência antimicrobiana

Abstract

Pseudomonas aeruginosa é um importante patógeno no âmbito hospitalar. O presente estudo teve o objetivo de caracterizar isolados clínicos de P. aeruginosa de pacientes portadores e não portadores de fibrose cística com relação a sua habilidade para produção de biofilmes, requerimento nutricional, expressão fenotípica da produção de moléculas autoindutoras do sistema quorum-sensing (QS), detecção de genes envolvidos no controle do sistema QS e detecção de genes carbapenemases, sobretudo metalo-β-lactamases (MBLs). Preliminarmente, 74 P. aeruginosa foram avaliadas com relação à capacidade de produção de biofilme. Nesta análise, 68% mostraram serem produtores de biofilme. Subseqüentemente, a produção de biofilme foi avaliada em 124 isolados clínicos utilizando-se dois diferentes meios: Tryptic Soy Broth (TSB) e um pool de escarros provenientes de pacientes com fibrose cística. A capacidade de produção de biofilme, nos dois meios, não apresentou diferença estatiscamente significativa, independentemente da origem dos isolados (fibrose cística ou não). Entretanto, uma maior produção de biofilme foi observada quando os isolados foram submetidos a este crescimento no meio TSB (p=0,0198). Os isolados clínicos produtores de biofilme que foram obtidos de pacientes sem fibrose cística mostraram ser mais resistentes aos carbapenêmicos - imipenem e meropenem - do que aqueles isolados de pacientes com fibrose cística. A auxotrofia foi avaliada entre 349 isolados de P. aeruginosa e detectada em 14 (4%) amostras, sendo apenas uma oriunda de paciente não-fibrocístico. O aminoácido mais requerido foi metionina (Met-) (8/14). As amostras auxotróficas foram avaliadas quanto a capacidade de produzir biofilme e apenas um isolado (Met-) foi não produtor de biofilme. Este foi o primeiro relato de auxotrofia entre P. aeruginosa isoladas de amostras clínicas no Brasil. Muitos mecanismos, principalmente aqueles associados à virulência de P. aeruginosa, são controlados pelo sistema QS através de moléculas conhecidas como autoindutoras (AHLs). Neste estudo não encontramos diferença significativa entre isolados de fibrose cística e não fibrose cística, referente à detecção fenotípica de AHLs. Entretanto, a produção de moléculas autoindutoras parece estar associada àqueles com maior capacidade de produção de biofilme, mostrando ser uma característica relacionada à densidade microbiana. Quanto aos genes de resistência aos carbapenêmicos, 91 isolados foram avaliados para presença dos genes SPM-1, IMP-1 e VIM-2 codificadores de MBLs, pela reação em cadeia da polimerase. Entre estes, 21 (23.1%) isolados foram positivos para genes de MBLs. A presença do gene SPM-1 foi maior entre os isolados não-fibrocísticos. Por outro lado, nós encotramos uma elevada prevalência do gene IMP-1 entre isolados de P. aeruginosa de pacientes com fibrose cística. Ao nosso conhecimento, este é o primeiro relato no Brasil, de P. aeruginosa IMP-1 em pacientes com fibrose cística. Adicionalmente, todos isolados positivos para a presença de MBL mostraram capacidade, sobretudo moderada e forte, para produção de biofilme. Testes fenotípicos têm sido utilizados para predizer a presença de MBL em P. aeruginosa. Entretanto, nenhum tem sido preconizado pelos comitês internacionais. Nós avaliamos 14 diferentes combinações de testes fenotípicos de 1) sinergismo utilizando ceftazidima (CAZ) e imipenem (IMP) como substratos e ácido 2-mercaptopropiônico (2MPA) e ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) como agentes inibidores da enzima em distâncias de 1, 2 e 2,5 cm entre os discos e de 2) disco-combinado de IMP e/ou CAZ com EDTA para predizer a presença de MBL. Nesta etapa de estudo, foram avaliadas amostras provenientes de um surto hospitalar (n=7) e amostras de pacientes com fibrose cística (n=14). Nós encontramos uma tendência de melhor resultado para o teste de disco combinado IMP-EDTA, embora um resultado falso-positivo tenha ocorrido. Finalmente, foi realizada uma análise para avaliação da presença dos genes que compõem os principais sistemas de QS e sua correlação com a produção de biofilme e moléculas AHLs. Um total de 91 isolados (85 produtores de biofilme e 6 não produtores de biofilme) foi avaliado. Entre os não produtores de biofilme, quatro isolados foram negativos para genes lasI, lasR, rh/I e rh/R, e dois foram negativos para lasI e lasR. Este resultado mostra a importância do sistema las no controle da virulência em P. aeruginosa, sobretudo no processo de formação de biofilme.

Pseudomonas aeruginosa is an important pathogen that causes serious illness, especially in hospital settings, such as pneumonia, bacteremia and sepsis. This study aimed do characterize clincial isolates of P. aeruginosa from patients with and without cystic fibrosis (CF) according to their ability to produce biofilm, nutritional requirement, phenotypic expression of autoinducers molecules of quorum-sensing system (QS), detection of genes involved in control of the QS system and detection of metallo-β-lactamases (MBLs) genes. In a preliminary analysis, 74 P. aeruginosa were evaluated for the ability to produce biofilm and 68% proved to be biofilm producers. Subsequently, biofilm production was assessed in 124 isolates using two different media: Tryptic Soy Broth (TSB) and a pool of sputum from CF patients. There was no statistical difference in biofilm production regardless the origing of isolates (cystic fibrosis or non-CF), in both media. However, increased production of biofilm was observed when the isolates were submitted to grow in TSB medium (p = 0,0198). Biofilm producers from non-CF patients showed to be more resistant to carbapenems - imipenem and meropenem. Occurence of auxotrophy is well documented among P. aeruginosa isolates from CF, and represents a bacterial adaptation to the pulmonary environment. The auxotrophy was evaluated among 349 isolates of P. aeruginosa and was detected in 14 (4%) isolates. All but one auxotrophic isolates were obtained from CF patients. The single amino acid more required was methionine (Met-) (8/14). Auxotrophic isolates were evaluated for biofilm production and only one Met- isolated was non-biofilm producer. This was the first report of auxotrophic in P. aeruginosa isolated from clinical specimens in Brazil. The virulence factors in P. aeruginosa are controlled by the QS system through molecules known as autoinducers (AHLs). We found no significant difference between CF and non-CF isolates regarding AHLs production. However, the production of autoinducers molecules appears to be associated with isolates with major capacity to form biofilm. Regarding resistence mechanisms, we evaluated 91 isolates for the presence of SPM-1, IMP-1 and VIM-2 genes that encoding MBLs. A total of 21 (23.1%) isolates were MBL producers. The presence of SPM-1 gene was more common among non-CF isolates while the IMP-1 gene was more prevalent in CF P. aeruginosa isolates. To our knowledge, this is the first report of P. aeruginosa harboring IMP-1 gene among CF patients. Additionally, all isolates harboring MBLs showed ability, especially moderate and strong, for biofilm production. Phenotypic tests have been used to predict the presence of MBL in P. aeruginosa. However, none has been recommended by international committees. We evaluated 14 different combinations of the phenotypic tests to predict the presence of MBL 1) double-disk synergy test, using ceftazidime (CAZ) and imipenem (IMP) as substrates and acid 2-mercaptopropiônico (2MPA) and ethylenediaminetetracetic acid (EDTA) as inhibitors of the enzyme at distances of 1, 2 and 2.5 cm between the disks; and 2) combined-disk using IMP and/or CAZ with EDTA. We evaluated isolates from a hospital outbreak (n=7) and isolates from CF patients (n=14). We found a tendency toward better result for the combined-disk test with IMP-EDTA, although a false-positive result has occurred. Finally, we evaluated the presence of genes that comprise the main QS system of P. aeruginosa in relation to biofilm and AHLs production. A total of 91 isolates (85 producers and 6 non-biofilm producers) was evaluated. Among non-biofilm producers, four isolates were deficient for lasI, lasR, rh/I and rh/R genes, and two isolates were deficient for lasI and lasR genes. This result shows the importance of the QS systems, mainly las system, in controlling P. aeruginosa virulence, mainly in process in which biofilm production can be occurring.