Hidrólise extracelular de nucleotídeos em Trichomonas vaginalis : caracterização bioquímica e localização enzimática

Abstract

Trichomonas vaginalis é o protozoário flagelado causador da tricomonose, a doença sexualmente transmissível (DST) não virai mais comum no mundo. O T. vaginalis tem se destacado como um importante patógeno e está associado a graves complicações de saúde. Considerando o sério impacto da tricomonose na saúde pública, é importante estudar os aspectos bioquímicos do T. vaginalis que contribuem para infecção do hospedeiro e patogênese. Nucleotídeos extracelulares estão envolvidos em uma variedade de funções fisiológicas e patológicas, além de apresentarem propriedades citotóxicas. Os nucleotídeos extracelulares podem ser hidrolisados via ectonucleotidases, incluindo a família E-NTPDase (ectonucleosídeo trifosfato difosfoidrolase) e a ecto-5'-nucleotidase. Uma atividade de NTPDase1 foi previamente caracterizada em T. vaginalis. Nossos resultados mostraram a caracterização de uma ecto-5'-nucleotidase dependente de magnésio e cálcio e com atividade máxima em pH alcalino. Os valores de Km (Constante de Michaelis) situaram-se na faixa micromolar, com ampla especificidade a nucleosídeos monofosfatados. A atividade de ecto-5'-nucleotidase em T. vaginalis foi inibida pelo 5'-[α,ß-metileno]difosfato (AMPCP), inibidor específico da enzima em vertebrados. O metronidazol e o tinidazol apresentaram efeitos diversos na atividade da NTPDase1 e da ecto-5'nucleotidase de um isolado de T. vaginalis proveniente da American Type Culture Collection (ATCC) cultivado por longo período no laboratório e de um isolado clínico fresco. A hidrólise de ATP foi aumentada na presença de metronidazol no isolado ATCC. Por outro lado, ela foi inibida pelo tinidazol no isolado clínico fresco. O tratamento dos parasites na presença de metronidazol por 2h inibiu a hidrólise de ATP e ADP, enquanto o tratamento com tinidazol inibiu as atividades ATPásica e ADPásica somente no isolado clínico fresco. Os fármacos não produziram efeitos significativos na atividade da ecto-5'-nucleotidase de ambos os isolados de T. vaginalis testados. Os dados sugerem a função da NTPDase1 como moduladora da concentração de nucleotídeos extracelulares na presença de metronidazol e tinidazol, uma condição adversa para o parasito. Através de citoquímica enzimática, ambas as enzimas demonstraram ecto-localização, confirmando os mecanismos presentes no parasito capazes de realizar hidrólise extracelular de nucleotídeos. Diferentes concentrações de nucleotídeos da adenina e de adenosina não exerceram efeitos citolíticos nos trofozoítos. As atividades ATPásica e ADPásica apresentam-se mais elevadas em isolados clínicos frescos em comparação a isolados cultivados por longos períodos. A heterogeneidade foi demonstrada entre os diferentes isolados de T. vaginalis com relação à razão de hidrólise ATP:ADP. Alguns isolados apresentaram razão de hidrólise ATP:ADP igual a 1:0,8, característica de NTPDase1, enquanto outros apresentaram uma razão de hidrólise ATP:ADP de aproximadamente 2:1. Os isolados de T. vaginalis apresentaram diferenças dramáticas nos níveis de atividade da ecto-5'-nucleotidase e, surpreendentemente, alguns isolados apresentaram muito baixa ou nenhuma atividade. Diferentes condições de cultivo foram testadas e não apresentaram efeitos na elevação dos níveis da atividade enzimática. A ausência de atividade de hidrólise de AMP pelo T. vaginalis pode acarretar importantes conseqüências para ambos hospedeiro e parasito durante a infecção. O cultivo dos parasites em meio de cultura com e sem a adição de ferro não apresentou efeitos dramáticos na atividade da NTPDase dos diferentes isolados. Ao contrário, concentrações baixas e elevadas de ferro apresentaram decréscimo e aumento, respectivamente, na atividade da ecto-5'-nucleotidase daqueles isolados que apresentaram atividade sob condições normais de cultivo. Considerando os altos níveis de nucleotídeos púricos no sítio do T. vaginalis, a ausência de efeitos citolíticos nos parasites e a ecto-localização das enzimas envolvidas na hidrólise de nucleotídeos, sugere-se que a NTPDase1 e a ecto-5'-nucleotidase modulam as concentrações extracelulares de ATP, ADP e AMP. O produto final dessas reações, o nucleosídeo adenosina, é recaptado pelas vias de salvação.

The flagellated protozoan, Trichomonas vaginalis, causes trichomonosis, the most prevalent non-viral sexually transmitted disease (STD) worldwide. lnfection with T. vaginalis has major health consequences for women. Taking in account the serious impact caused by trichomonosis on public health, it is important to study the biochemical aspects of T. vaginalis that contribute with host infection and pathogenesis. Extracellular nucleotides are involved in several physiologic and pathologic functions, including cytotoxic properties. Nucleotides are hydrolyzed by ectonucleotidases, including E-NTPDase (ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase) family and ecto-5'-nucleotidase. A NTPDase1 activity was previously characterized in T. vaginalis. Our results show the characterization of an ecto-5'nucleotidase activity, magnesium- and calcium-dependent and with maximum activity in alkaline pH. Km (Michaelis Constant) values are in the micromolar range, with broad monophosphate nucleosides specificity. The ecto-5'-nucleotidase activity from T. vaginalis was inhibited by 5'-[α,ß-methylene]diphosphate (AMPCP), the specific inhibitor of this enzyme in vertebrates. Metronidazole and tinidazole presented different effects on NTPDase1 and ecto-5'-nucleotidase activities from T. vaginalis long-term-grown isolate from American Type Culture Collection (ATCC) and from a fresh clinical isolate. ATP hydrolysis was activated in presence of metronidazole in the ATCC strain, whilst it was inhibited by tinidazole in a fresh clinical isolate. The treatment of cells in presence of metronidazole for two hours inhibited ATP and ADP hydrolysis, whilst treatment with tinidazole inhibited ATP and ADP hydrolysis only in the fresh clinical isolate. The drugs did not change the ecto-5'nucleotidase activity for both strains. Our results suggest that the modulation of extracellular A TP and ADP levels during treatment with these drugs could be a parasitic defense strategy as a survival mechanism in an adverse environment. Cytochemical localization showed that both NTPDase1 and ecto-5'-nucleotidase presented ecto-localization, reinforcing the mechanisms present in T. vaginalis capable to hydrolyze extracellular nucleotides. Different adenine nucleotides and adenosine concentrations did not produce any cytolytic effects on trophozoites. ATPase and ADPase activities were higher in fresh clinical isolates when compared to long-term-grown isolates. Heterogeneity on ATP:ADP hydrolysis ratio was shown among different T. vaginalis isolates. Some isolates had ATP:ADP hydrolysis ratio of 1:0.8, characteristic of NTPDase1, whilst other isolates presented ATP:ADP hydrolysis ratio of approximately 2:1. T. vaginalis isolates had dramatic differences in levels of ecto-5'nucleotidase activity, and surprisingly, some isolates had little or no enzymatic activity. Different growth conditions were without effect in elevating levels of ecto-5'-nucleotidase activity. This lack of ecto-5'-nucleotidase activity by T. vaginalis may have important consequences for both host and parasite during infection. Growth of trichomonads in ironreplete and iron-depleted medium had overall little dramatic effect in distinct pattems in NTPDase activity among fresh isolates. ln contrast, high- and low-iron trichomonads had increased and decreased ecto-5'-nucleotidase activity, respectively, among fresh isolates with activity detectable under normal medium conditions. Taking in account the high purine nucleotides levels present in vagina, the T. vaginalis site, the lack of cytolytic effects on parasites and the ecto-localization of enzymes involved on nucleotide hydrolysis, it is suggested that NTPDase1 and ecto-5'-nucleotidase modulate extracellular ATP, ADP and AMP concentrations. The final product, adenosine, is reuptake by salvage pathways.