Do cultivo a novas estratégias terapêuticas : otimização estatística dos meios de cultura e da susceptibilidade associados à busca de novas moléculas e combinações no combate a micoses pulmonares

Abstract

As micoses pulmonares apresentam sintomas inespecíficos ou são até mesmo assintomáticas, o que impacta no diagnóstico precoce e consequentemente no início da terapia para um bom prognóstico. Pacientes imunodeprimidos são os mais acometidos, nesses indivíduos as taxas de letalidade são altas e o tratamento é prolongado. Aspergillus e Cryptococcus estão entre os gêneros mais isolados em infecções pulmonares. Poucas opções terapêuticas estão disponíveis para Cryptococcus spp., e casos crescentes de resistência são observados para Aspergillus spp. mostrando a necessidade da busca por novas alternativas terapêuticas. É importante ressaltar que a taxa de crescimento e outras características de crescimento podem variar amplamente entre diferentes espécies de leveduras, incluindo as do gênero Cryptococcus e Candida. Essas diferenças podem ter implicações significativas na detecção e tratamento de infecções fúngicas. Esse fato impacta diretamente nos métodos de avaliação de suscetibilidade, crescimento em meios sólidos, entre outras metodologias, sendo necessário a busca pelo pleno crescimento durante ensaios biológicos. Como novas alternativas terapêuticas, esse trabalho avaliou o desempenho de derivados quinolínicos sobre espécies de Aspergillus e Cryptococcus. Para Cryptococcus, os derivados mostraram uma ótima atividade, com concentrações inibitórias mínimas (CIM) de ≤ 2 μg/mL, entre eles, os mais ativos foram clioquinol (CQ) e PH153. Os mecanismos de ação revelam que estes compostos não se ligam ao ergosterol presente na membrana celular fúngica. Entretanto, a presença de 0,8 M de sorbitol influenciou na atividade dos compostos, que por terem características quelantes de metais podem estar retardando o desbalanço osmótico da célula. Em consequência a esse provável mecanismo também foi observada a inibição da síntese de melanina, dependente de metais e um importante fator de virulência. Os testes de curvas de morte, bem como a concentração fungicida mínima (CFM) corroboram o provável mecanismo de ação, uma vez que seu comportamento é fungistático, ocorrendo a morte das leveduras por inanição. No caso de Aspergillus spp. os derivados também apresentaram atividade, porém a melhor CIM foi obtida com o CQ. Combinações binárias e ternárias foram realizadas utilizando CQ, anfotericina B (AFB) e itraconazol (ITZ). Misturas de fármacos que apresentaram 14 sinergismo significativo, como a combinação de CQ+ITZ e AFB+ITZ, permitiram reduzir as concentrações necessárias em mais de seis vezes em relação às CIM dos fármacos quando usados individualmente. Combinações também foram exploradas para espécies de Cryptococcus utilizando CQ, AFB, fluconazol (FLZ) e 8-hidroxiquinolina (8HQ). A combinação que obteve o melhor sinergismo foi observada entre FLZ na presença de CQ ou 8HQ, resultando um escore de sinergismo três vezes superior aos encontrado para FLZ+AFB, utilizados no tratamento da criptococose com doses diárias de 400-800 mg e 0,5-1 mg/kg, respectivamente, por dia. A concentração de FLZ foi reduzida de aproximadamente 4 μg/mL (50% de inibição) para 0,125 μg/mL na presença de CQ, inibindo mais de 90% do crescimento fúngico. Além disso, a combinação de FLZ+CQ inibiu a produção de melanina, não apresentou toxicidade aguda em modelo in vivo alternativo utilizando larvas de Tenebrio molitor, e ausência de irritabilidade nas concentrações testadas constatada através da metodologia de HET-CAM (membrana corioalantóica embrionária de ovos de galinhas). As combinações realizadas, bem como o uso dos derivados sozinhos apresentaram boas estratégias terapêuticas a serem exploradas para o tratamento da aspergilose e criptococose. Embora Aspergillus apresente uma condição de crescimento abundante e relativamente rápido, Cryptococcus por ser uma levedura apresenta um crescimento sub-ótimo. O estudo realizado através da comparação de métodos de fabricação do meio de cultivo sólido ágar sabouraud dextrose (ASD) mostra que a autoclavagem influencia diretamente no crescimento de Cryptococcus em ASD. O tempo prolongado de exposição a altas temperaturas de ASD provoca a degradação de nutrientes, bem como o acúmulo de produtos dessa degradação podem exercer um efeito antimicrobiano. Em meio de cultivo líquido, Cryptococcus apresentou melhor crescimento em meio RPMI na presença de 0,0330 M de MOPS, pH 5,5, 2% de glicose e inóculo de aproximadamente 8 x 104 permitindo também a melhor determinação das CIMs para AFB e FLZ. As modificações estudadas neste meio de cultivo representam uma alternativa interessante para a melhor determinação das CIMs e, consequentemente, a geração de pontos de corte clínico para outros antifúngicos.

Pulmonary mycoses have nonspecific symptoms or are even asymptomatic, which impacts early diagnosis and consequently initiation of therapy for a good prognosis. Immunosuppressed patients are the most affected, in these individuals the mortality rates are high and the treatment is prolonged. Aspergillus and Cryptococcus are among the most isolated genera in pulmonary infections. Few therapeutic options are available for Cryptococcus spp., and increasing cases of resistance are observed for Aspergillus spp. showing the need to search for new therapeutic alternatives. Importantly, growth rate and other growth characteristics can vary widely between different yeast species, including those of the Cryptococcus and Candida genera. These differences can have significant implications for the detection and treatment of fungal infections. This fact has a direct impact on the methods of evaluating susceptibility, and growth in solid media, among other methodologies, requiring the search for full growth during biological assays. As new therapeutic alternatives, this work evaluated the performance of quinolinic derivatives on Aspergillus and Cryptococcus species. For Cryptococcus spp., the derivatives showed excellent activity, with minimum inhibitory concentrations (MIC) of ≤ 2 μg.mL-1, among them, the most active were clioquinol (CQ) and PH153. The mechanisms of action reveal that these compounds do not bind to the ergosterol present in the fungal cell membrane. However, the presence of 0.8 M of sorbitol influenced the activity of the compounds, which, due to their metal chelating characteristics, may be delaying the osmotic imbalance of the cell. As a result of this probable mechanism, inhibition of melanin synthesis, which is metal-dependent and an important virulence factor, was also observed. The death curve tests, as well as the minimum fungicidal concentration (MFC), corroborate the probable mechanism of action, since its behavior is fungistatic, with the death of yeasts due to starvation. In the case of Aspergillus spp. derivatives also showed activity, but the best MIC was obtained with CQ. Binary and ternary combinations were performed using CQ, amphotericin B (AMB), and itraconazole (ITZ). Mixtures of 16 drugs that showed significant synergism, such as the combination of CQ+ITZ and AMB+ITZ, allowed for a reduction of the necessary concentrations by more than six-times concerning the MIC of the drugs when used individually. Combinations were also explored for Cryptococcus species using CQ, AMB, fluconazole (FLZ), and 8-hydroxyquinoline (8HQ). The combination that obtained the best synergism was observed between FLZ in the presence of CQ or 8HQ, resulting in a synergism score three times higher than those found for FLZ+AMB, used in the treatment of cryptococcosis with daily doses of 400-800 mg and 0.5 -1 mg/kg, respectively, per day. FLZ concentration was reduced from approximately 4 μg.mL-1 (50% inhibition) to 0.125 μg.mL-1 in the presence of CQ, inhibiting more than 90% of fungal growth. In addition, the combination of FLZ+CQ inhibited melanin production, did not show acute toxicity in an alternative in vivo model using Tenebrio molitor larvae, and lack of irritability at the tested concentrations verified through the methodology of HET-CAM (embryonic chorioallantoic membrane of chicken eggs). The combinations performed, as well as the use of the derivatives alone, presented good therapeutic strategies to be explored for the treatment of aspergillosis and cryptococcosis. Although Aspergillus spp. presents an abundant and relatively fast growth condition, Cryptococcus spp., being a yeast, presents a sub-optimal growth. The study carried out through the comparison of manufacturing methods of solid culture medium Sabouraud dextrose agar (SDA) shows that autoclaving directly influences the growth of Cryptococcus in SDA. The prolonged time of exposure to high temperatures of SDA causes the degradation of nutrients, as well as the accumulation of products of this degradation that can exert an antimicrobial effect. In liquid culture medium, Cryptococcus grew better in RPMI medium in the presence of 0.0330 M MOPS, pH 5.5, 2% glucose, and approximately 8 x 104 inoculum, also allowing better determination of MICs for AMB and FLZ. The modifications studied in this culture medium represent an interesting alternative for better determination of MICs and, consequently, the generation of clinical cutoff points for other antifungals.