Identificação de genes importantes para a translocação de Fe e Zn para os grãos de arroz (Oryza sativa L.)

Abstract

O arroz é o alimento base para metade da população mundial. Entretanto, é uma fonte pobre em micronutrientes essenciais como Fe e Zn, que são removidos durante o processamento do grão para produção de alimento. Por essa razão, populações cujas dietas baseiam-se principalmente em arroz estão sujeitas à deficiência de Fe e Zn, que são as deficiências nutricionais mais comuns no mundo, afetando mais de dois bilhões de pessoas. Uma vez que as folhas-bandeira são uma das fontes de remobilização de metais para os grãos em desenvolvimento, a identificação dos mecanismos moleculares que contribuem no processo de transporte de metais das folhas-bandeira para os grãos pode ser útil em programas de biofortificação. Dessa forma, utilizamos duas abordagens diferentes para estudar esta questão. Primeiro, realizamos uma análise por hibridização subtrativa supressora (SSH) em folhas-bandeira de duas cultivares de arroz e isolamos 78 sequências induzidas no estágio de enchimento do grão (R5) em relação ao estágio de emergência da panícula (R3). A expressão diferencial de alguns genes selecionados (entre eles do fator de transcrição OsNAC5) foi confirmada por PCR quantitativo. Mostramos que a expressão de OsNAC5 é ativada em processos de senescência natural (envelhecimento) e induzida (escuro, aplicação de ABA, alta salinidade, frio e deficiência de Fe) e sua expressão não é afetada na presença de 6- benzilaminopurina (um inibidor de senescência) em condição de senescência induzida por escuro. A indução da expressão de OsNAC5 sob alta salinidade é abolida por nicotinamida, um inibidor dos efeitos do ABA. Este resultado e a presença de elementos cis-atuantes na região promotora do gene OsNAC5 sugere uma regulação dependente de ABA. Utilizando quatro diferentes cultivares de arroz, mostramos que a indução de OsNAC5 é maior e antecipada em folhas-bandeira e panículas de plantas da cultivar IR75862, que possui as maiores concentrações de Fe, Zn e proteínas nas sementes. Dessa forma, sugerimos que OsNAC5 é um fator de transcrição do tipo NAC dependente de ABA e associado à senescência, e sua função pode estar relacionada à remobilização de Fe, Zn e aminoácidos dos tecidos verdes para os grãos. Posteriormente, analisamos a expressão de 25 genes de arroz relacionados à homeostase de metais em folhas-bandeira de oito cultivares de arroz (com níveis contrastantes de Fe e Zn nos grãos) durante os estágios de emergência da panícula (R3) e enchimento do grão (R5). Nove destes genes (OsYSL6, OsYSL8, OsYSL14, OsNRAMP1, OsNRAMP7, OsNRAMP8, OsNAS1, OsFRO1 e OsNAC5) apresentaram correlação significativa entre os níveis de expressão em folhas-bandeira e as concentrações de Fe e Zn nas sementes. Assim, nosso estudo forneceu uma pequena lista de possíveis genes-alvo para manipulação da concentração de Fe e Zn em grãos de arroz.

Rice is the staple food for half of the world population. However, it is a poor source of essential micronutrients such as Fe and Zn, most of which are lost during grain processing for food production. For this reason, populations with monotonous diets consisting mainly of rice are especially prone to Fe and Zn deficiency, which are the most common and widespread nutritional disorders in the world, affecting more than 2 billion people. Since flag leaves are one of the sources of remobilized metals for developing seeds, the identification of the molecular players that might contribute to the process of metal transport from flag leaves to the seeds may be useful for biofortification purposes. In this way, we used two different appraches to address this issue. First, we conducted suppression subtractive hybridization (SSH) analysis in flag leaves of two rice cultivars and isolated 78 sequences up-regulated in flag leaves at the grain filling stage (R5) relative to the panicle exertion stage (R3). Differential expression of selected genes (including the OsNAC5 transcription factor) was confirmed by quantitative RT-PCR. We showed that OsNAC5 expression is up-regulated by natural (aging) and induced senescence processes (dark, ABA application, high salinity, cold and Fedeficiency) and its expression is not affected in the presence of 6-benzylaminopurine (a senescence inhibitor) under dark-induced senescence. Salt induction of OsNAC5 expression is abolished by nicotinamide, an inhibitor of ABA effects. This result and the presence of cis-acting elements in the promoter region of the OsNAC5 gene suggest an ABA-dependent regulation. Using four different rice cultivars, we showed that OsNAC5 up-regulation is higher and earlier in flag leaves and panicles of IR75862 plants, which have higher seed concentrations of Fe, Zn and protein. We suggest that OsNAC5 is a novel senescenceassociated ABA-dependent NAC transcription factor and its function could be related to Fe, Zn and amino acids remobilization from green tissues to seeds. We also analyzed the expression of 25 metal-related genes from rice in flag leaves of eight rice cultivars (showing contrasting levels of seed Fe and Zn) during panicle emergence (R3) and grain filling stage (R5). The expression level of nine of these genes (OsYSL6, OsYSL8, OsYSL14, OsNRAMP1, OsNRAMP7, OsNRAMP8, OsNAS1, OsFRO1 and OsNAC5) in flag leaves exhibited significant correlations with Fe and/or Zn concentrations in the seeds. In this way, our study has provided a short list of putative target genes to manipulate Fe and Zn concentrations in rice grains.