Metarhizium anisopliae : expressão de proteína tóxica de origem vegetal e análise genômica de quitinases

Abstract

Dentre os agentes biocontroladores de insetos-praga, o fungo filamentoso Metarhizium anisopliae é considerado um organismo-modelo para o estudo das interações patógenohospedeiro devido a sua capacidade e eficiência para infectar inúmeros artrópodes. Seus hospedeiros compreendem pragas da agricultura, da pecuária e vetores de doenças humanas. A eficácia de M. anisopliae pode ser aumentada em relação ao tempo necessário para matar o hospedeiro em comparação ao controle químico. Uma alternativa é o desenvolvimento de linhagens melhoradas que sejam comercialmente viáveis e mais eficazes. Essa otimização pode ser obtida pela superexpressão de genes determinantes da virulência deste entomopatógeno ou de proteínas tóxicas inseticidas. Neste contexto, em uma primeira etapa do trabalho, desenvolvemos construções com o peptídeo entomotóxico Jaburetox-2Ec oriundo da legiminosa Canavalia ensiformis para potencializar a ação de M. anisopliae contra seus hospedeiros. O peptídeo foi utilizado na construção de um vetor para expressão da entomotoxina em linhagens recombinantes de M. anisopliae, obtidas por agrotransformação (transformação mediada por Agrobacterium tumefaciens). A presença do peptídeo Jaburetox-2Ec (~13 kDa) na fração intracelular de quatro transformantes deste fungo foi detectada por ensaio de Western blot, no entanto o peptídeo apresentou-se em forma de agregados inativos com tamanho superior a 30 kDa. Também foi realizado o isolamento da região promotora e do peptídeo sinal presentes no gene da trealase ácida de M. anisopliae para permitir a expressão de Jaburetox fusionado a um peptídeo sinal de exportação celular e sob regulação do promotor da trealase ácida, o qual é induzido por trealose, o principal açúcar presente na hemolinfa de insetos. Em uma segunda etapa deste trabalho, foi realizado um estudo em escala genômica das quitinases putativas no genoma de M. anisopliae. Esta família de proteínas está diretamente envolvida na patogenicidade de M. anisopliae, e é responsável pela dissolução do exoesqueleto quitinoso dos hospedeiros, além de apresentarem função estrutural, morfológica, autolítica e nutricional em fungos e, portanto, potencialmente importante nas várias etapas do processo de infecção. A metodologia de biomineração realizada no genoma de M. anisopliae E6 permitiu identificar 23 quitinases preditas (incluindo as três quitinases isoladas experimentalmente CHIT42, CHI2 e CHIT30) pertencentes à família 18 das glicosil hidrolases, classificando-as em quatro subgrupos filogenéticos sendo três destes propostos anteriormente e o subgrupo D, proposto neste trabalho. Apresentamos uma análise detalhada da organização de domínios, peptídeos sinal e íntrons nestes genes chi propostos. Sendo M. anisopliae um entomopatógeno com alta capacidade de infecção, a determinação do número de quitinases que pode estar presente neste organismo e o estudo detalhado deste sistema quitinolítico representa uma perspectiva de estudo importante para o consequente melhoramento de linhagens deste fungo para potencializar o biocontrole. O biocontrole mais eficiente poderá resultar da seleção de linhagens com expressão aumentada de enzimas hidrolíticas, como as quitinases, que são fundamentais na penetração através do hospedeiro e da superexpressão de toxinas inseticidas na hemolinfa.

Amongst pests biocontrol agents, the filamentous fungi Metarhizium anisopliae is considered a model to study host-pathogen interactions due to its efficiency and capability to infect innumerous arthropods. M. anisopliae hosts ranges from agricultural and pasture pests to human disease vectors. M. anisopliae biocontrol efficacy can be enhanced and one of its major purposes is to overcome the actual existing limitations concerning the slow kill when compared to chemical control. Therefore, the development of cost-effective improved strains is highly desirable. This improvement can be performed by overexpressing fungal virulence genes or entomotoxic proteins. Thus, as the first part of the work we have undertaken the construction of strains expressing the highly potent insecticidal peptide Jaburetox-2Ec, originated from the leguminosae Canavalia ensiformis which may potentiate M. anisopliae action against its hosts. The peptide sequence was used to construct a toxin expression vector applicable to obtain recombinant M. anisopliae isolates trough agrotransformation (Agrobacterium tumefaciens mediated transformation). Jaburetox-2Ec (~13 kDa) was detected by Western blot assay at the fungal intracellular fraction in four recombinant isolates. The peptide was present as an inactive aggregated form with molecular mass superior to 30 kDa. We have also isolated and characterized the M. anisopliae acid trehalase promoter region and signal peptide in order to construct a vector that will allow a signal peptide-Jaburetox-2Ec fusion expression regulated by acid trehalase promoter, which is induced by the main insect haemolymph sugar (trehalose). The second part of the work aimed the description of the M. anisopliae putative chitinases in a genomic scale. Members of this protein family have been directly implicated in M. anisopliae pathogenicity, being responsible for host exoskeleton dissolution; in addition to the participation in structural, morphological, autolytic and nutritional activities related to the infection process. The biomining methodology performed with the M. anisopliae genome was successful to identify 23 potential chitinases (including the three experimentally isolated chitinases CHIT42, CHI2 e CHIT30) belonging to glycoside hydrolase family 18 and classified into the three described chitinase subgroups and a proposed fourth subgroup. We performed detailed analyses of the domain organization, signal peptides and intron structure. For a highly infective entomopathogen as M. anisopliae the chitinase number determination and a more detailed study concerning this chitinolytic system represents an important perspective for the consequent biocontrol strain improvement. Improved strains for biocontrol may result from the synergistic overexpression of hydrolytic enzymes, like host cuticle dissolvent chitinases that could be found screening the biodiversity, and by the expression of entomotoxins that act at host haemolymph.