Efeito das tarefas comportamentais de habituação e esquiva inibitória sobre a fosforilação in vitro de proteínas do citoesqueleto de hipocampo de ratos

Abstract

Neste trabalho utilizamos uma fração citoesquelética insolúvel em Triton X-100 obtida a partir de hipocampo de ratos adultos a qual era incubada com ³²P-ATP in vitro. As fosfoproteínas foram identificadas através de eletroforese bidimensional em condições de não equilíbrio, imunodetecção e através da utilização de um padrão de tubulina. São elas: NF-M, sinapsina 1, NF-L, α tubulina e GFAP. As atividades quinásicas endógenas dependentes de 2° mensageiro associadas à fração citoesquelética foram estudadas através da utilização de seus ativadores específicos. Os resultados indicaram que a fração citoesquelética possui duas atividades quinásicas endógenas dependentes de 2° mensageiro, as quais são: a quinase dependente de cálcio e calmodulina (CaM quinase) e a quinase dependente de AMP cíclico (quinase A). Para o estudo da atividade fosfatásica foi utilizada uma curva de concentrações crescentes (0,05; 0,5 e 5 μM) de ácido ocadaico, um potente inibidor de fosfatases. Os resultados mostraram que a PP2A encontra-se associada à fração citoesquelética, defosforilando as proteínas da fração citoesquelética. As tarefas comportamentais estudadas neste trabalho alteraram a fosforilação in vítro de quatro fosfoproteínas constituintes da fração citoesquelética insolúvel em Triton X-100. A tarefa de habituação diminuiu a incorporação de ³²P-ATP in vitro na a tubulina e na GFAP, enquanto que a esquiva inibitória aumentou a fosforilação in vitro nas duas subunidades dos neurofilamentos (NF-M e NF-L). Nenhuma das duas tarefas teve efeito sobre a incorporação de ³²P na sinapsina 1. Além disso, o choque não foi capaz de alterar a fosforilação in vitro de nenhuma das fosfoproteínas estudadas. Com o objetivo de verificar se as alterações encontradas na incorporação de ³²P in vitro nestas proteínas, deviam-se a alterações na atividade quinásica ou fosfatásica, foram feitas as curvas de defosforilação, nas quais os sistemas foram incubados durante os seguintes tempos: 5, 10, 20 e 30 minutos. Nenhuma alteração foi detectada nas curvas de defosforilação de frações citoesqueléticas obtidas de ratos submetidos às tarefas comportamentais. Este resultado sugere que a alteração encontrada na incorporação de ³²P in vitro aos 5 minutos de incubação pode ser atribuída a alterações nas atividades quinásicas associadas a fração citoesquelética de hipocampo de ratos.