A melatonina reverte os danos no fígado e no DNA induzidos por dietilnitrosamina em ratos

Abstract

A cirrose apresenta prevalência crescente e alta mortalidade em nosso meio e representa a fase final comum das lesões hepáticas crônicas. Essa doença é caracterizada pela presença de fibrose e formação nodular difusa com perda da arquitetura hepática e grave alteração funcional sistêmica. A dietilnitrosamina (DEN) é um agente hepatotóxico capaz de produzir cirrose com padrão histológico similar ao da cirrose em humanos por meio da produção de espécies reativas de oxigênio. Existem evidências crescentes, na literatura, que consolidam a melatonina (MLT) como um potente antioxidante. Esse hormônio é capaz de interagir com o complexo transportador de elétrons na cadeia respiratória, aceitando ou doando elétrons e inibindo a lipoperoxidação (LPO). Este estudo teve como objetivo investigar a ação da MLT sobre o estresse oxidativo (EO), o processo inflamatório e fibrogênico e o dano ao DNA no modelo experimental de cirrose induzido por DEN. Foram utilizados 32 ratos machos Wistar com peso aproximado de 180g, os quais foram submetidos ao modelo experimental de cirrose hepática induzida por DEN e divididos em quatro grupos: 1) Controle (CO); 2) Controle+Melatonina (CO+MLT); 3) Dietilnitrosamina (DEN); 4) Dietilnitrosamina+Melatonina (DEN+MLT). Foi administrada DEN 50 mg/kg de peso do animal por via i.p. (intraperitoneal), duas vezes por semana, durante sete semanas, nos grupos DEN e DEN+MLT. A MLT foi administrada por via i.p. na dose de 20 mg/Kg diariamente a partir da quinta semana de experimento até a sétima semana nos grupos CO+MLT e DEN+MLT sempre às 19 horas, ao abrigo da luz. Foi monitorado o ganho de peso durante o experimento. Ao término da sétima semana, após um jejum de 12h, os animais foram anestesiados. A seguir, foi realizada a remoção do fígado, o qual foi pesado e avaliado em seus aspectos anatômicos. A coleta de sangue em torno de 3 ml foi feita por meio de punção cardíaca, sendo a amostra transferida imediatamente para um frasco devidamente preparado para análises séricas posteriores. O tecido hepático foi dissecado para as análises histológica, bioquímica e molecular. Por fim, os animais foram eutanasiados por exsanguinação. As análises histológicas foram realizadas por meio da coloração hematoxilina e Eosina (HE) e Picrosirius. O sangue coletado foi utilizado para análise das enzimas de integridade hepática: alanina aminotransferase (ALT), aspartato aminotransferase (AST) e fosfatase alcalina (FA). O homogeneizado de tecido foi utilizado para análise de EO por meio da técnica de substâncias que reagem ao ácido tiobarbitúrico (TBARS). As análises moleculares das proteínas a seguir foram feitas por Western Blot: superóxido dismutase (SOD), alfa actina do músculo liso (α-SMA), óxido nítrico sintase induzível (iNOS) e fator de transcrição nuclear Kappa B/porção 65 (NFkB/p65). Finalmente, os danos ao DNA foram analisados por meio do ensaio cometa (EC) e do teste de micronúcleos (MN). O modelo de cirrose hepática induzida por DEN foi eficaz em produzir as lesões hepáticas, e a MLT mostrou-se capaz de restaurar as provas de integridade hepática (ALT, AST e FA) para os níveis semelhantes ao do grupo CO. A MLT também restaurou o parênquima hepático diminuindo, a fibrose hepática e, consequentemente, os nódulos instalados o que ficou evidenciado pela diminuição na expressão de α-SMA. A MLT também diminuiu a LPO e aumentou a atividade da enzima antioxidante SOD. Observou-se diminuição do processo inflamatório evidenciada pela queda nos níveis de iNOS e NFkB/p65, e diminuição dos danos ao DNA, evidenciada pela técnica de EC. Os resultados sugerem que a MLT tem uma potente ação antioxidante e anti-inflamatória, podendo ser considerada, no futuro, como uma nova alternativa terapêutica.

Cirrhosis presents increasing prevalence and high mortality in our environment and represents the common final stage of chronic liver injury. This disease is characterized by the presence of fibrosis and diffuse nodular formation with loss of liver architecture and severe systemic functional alteration. Diethylnitrosamine (DEN) is a hepatotoxic agent capable of producing cirrhosis with a histological pattern similar to that of cirrhosis in humans through the production of reactive oxygen species. There is growing evidence in the literature that consolidates melatonin (MLT) as a potent antioxidant. This hormone is able to Interact with the electron transporter complex in the respiratory chain, accepting or donating electrons and inhibiting lipid peroxidation (LPO). This study aimed to investigate the action of MLT on oxidative stress (OE), inflammatory and fibrogenic process, and DNA damage in the experimental model of cirrhosis induced by DEN. We used 32 male Wistar rats weighing approximately 180g which were subjected to the experimental model of liver cirrhosis induced by DEN and divided into four groups: 1) Control (CO); 2) Control+Melatonin (CO+MLT); 3) Diethylnitrosamine (DEN); 4) Diethylnitrosamine+Melatonin (DEN+MLT). DEN was administered 50 mg/kg of animal weight via i.p., twice a week, for seven weeks, in the DEN and DEN+MLT groups. MLT was administered i.p. at a dose of 20 mg/Kg daily from the fifth week of the experiment until the seventh week in the CO+MLT and DEN+MLT groups, always at 7 pm, protected from light. Weight gain was monitored during the experiment. At the end of the seventh week, after a 12 h fast, the animals were anesthetized. Then, the liver was removed, weighed, and its anatomical aspects were evaluated. A blood sample of about 3ml was collected by cardiac puncture and the sample was immediately transferred into a flask properly prepared for further serum analysis. The liver tissue was dissected for histological, biochemical, and molecular analyses. Finally, the animals were euthanized by exsanguination. Histological analyses were performed by Hematoxylin and Eosin (HE) and Picrosirius staining. The collected blood was used for the analysis of liver integrity enzymes: alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST), and alkaline phosphatase (AP). The tissue homogenate was used for oxidative stress (OS) using the thiobarbituric acid-reacting substances technique (TBARS). Molecular analyses of the following proteins were done by western Blot: superoxide dismutase (SOD), smooth muscle alpha-actin (α-SMA), inducible nitric oxide synthase (iNOS), and nuclear transcription factor Kappa B/portion 65 (NFB/p65). Finally, DNA damage was analyzed using the comet assay (CA) and the micronucleus test (MN). The DENinduced liver cirrhosis model was effective in producing the liver lesions, and MLT was shoen to restore the liver integrity tests (ALT, AST, and AP) to levels similar to that of the CO group. MLT also restored the liver parehchyma by decreasing liver fibrosis and consequently the nodules installed which was evidenced by the decrease in α-SMA. MLT also decreased lipoperoxidation and increased the activity of the antioxidant enzyme SOD. It was observed a decrease in the inflammatory process, evidenced by a decrease in iNOS and NFkβ/p65 levels, and a decrease in DNA damage, evidenced by the CA technique. The results suggest that MLT has a potent antioxidant and anti-inflammatory action, and may be considered a new therapeutic alternative in the future.