Produção de insumos simplificados baseados em bactérias recombinantes para uso em reações de amplificação de ácidos nucleicos

Abstract

A expressão de proteínas recombinantes em Escherichia coli é vantajosa e viável devido a fácil manipulação genética, rápido crescimento, baixo custo e alta eficiência. Com os avanços da biotecnologia e a elevada demanda de ensaios moleculares de amplificação de ácidos nucleicos, como PCR e LAMP, a busca e competitividade por insumos proteicos fica evidente no mercado clinico e científico. Proteínas como as DNA-polimerases Taq e Bst e a transcriptase reversa MMLV-RT fazem parte da rotina de laboratórios moleculares. A produção simplificada baseada em bactérias recombinantes desses insumos apresentam vantagens como produção facilitada, baixo custo, alto rendimento e estabilidade a temperatura ambiente. Desta forma, objetivou-se produzir Taq, Bst e MMLV RT baseado em bactérias recombinantes para uso direto como células e extratos celulares em PCR e LAMP. Inicialmente, linhagens de E. coli foram transformadas com os respectivos plasmídeos das proteínas de interesse, seguida da padronização da expressão recombinante. Alíquotas das células expressando a Taq e a MMLV-RT foram utilizadas em PCR, qPCR e RT-PCR, e o extrato celular recombinante expressando a Bst foi utilizado no ensaio LAMP, ambas em substituição ao seu equivalente comercialmente disponível. Avaliamos a sensibilidade, especificidade e estabilidade das enzimas, as quais foram estáveis a temperatura ambiente e amplificaram o DNA molde, porém, nos ensaios de PCR e qPCR, efeitos negativos foram encontrados em ensaios com maior quantidade de células e menor concentração de DNA. No LAMP, foram obtidos bons resultados de amplificação utilizando o extrato celular da Bst recombinante. Em vista disso, a metodologia proposta é viável e acessível, sendo necessários mais estudos da aplicação dessa abordagem em ensaios moleculares.

The expression of recombinant proteins in Escherichia coli is advantageous and viable, due to easy genetic manipulation, rapid growth, low cost and high efficiency. With advances in biotechnology and the high demand for molecular nucleic acid amplification assays, such as PCR and LAMP, the demand and competitiveness for protein sample is evident in the clinical and scientific market. Proteins such as Taq and Bst DNA polymerases and MMLV- RT reverse transcriptase are part of the routine of molecular laboratories. The simplified production based on recombinant bacteria of these sample has advantages such as easy production, low cost, high yield and stability at room temperature. Thus, the objective was to produce Taq, Bst and MMLV RT based on recombinant bacteria for direct use as cells and cell extracts in PCR and LAMP. Initially, E. coli strains were transformed with the respective plasmids of the proteins of interest, followed by the standardization of protein expression. Aliquots of recombinant cells expressing Taq and MMLV-RT were used in PCR, qPCR and RT-PCR, and recombinant cell extract expressing Bst was used in the LAMP assay, both replacing their commercially available equivalent. We evaluated the sensitivity, specificity and stability of the enzymes, which were stable at room temperature and amplifying the DNA template, however, in the PCR and qPCR assays negative effects were found in assays with a greater number of cells and a lower concentration of DNA. In LAMP, good amplification results were obtained using the cell extract of recombinant Bst. In view of this, the proposed methodology is viable and accessible, requiring further studies to apply this approach in molecular assays.