Encapsulação de ditosilato de lapatinibe em nanocápsulas multiparede funcionalizadas com o anticorpo trastuzumabe : avaliação da atividade antitumoral

Abstract

Primeiramente, o objetivo desta tese foi realizar um levantamento bibliográfico sobre as aplicações biológicas das nanocápsulas de núcleo lipídico. Essa pesquisa resultou na elaboração de um artigo de revisão que contempla detalhes importantes sobre fatores metodológicos que influenciam nas características físico-químicas das nanocápsulas de núcleo lipídico, sua estrutura supramolecular, estratégias de marcação fluorescente e modificação de superfície. Posteriormente, desenvolvemos nanocápsulas de núcleo lipídico multiparede contendo o fármaco ditosilato de lapatinibe e funcionalizadas com anticorpo trastuzumabe (LAP-LNC+-TRAS), ambos inibidores do receptor tipo 2 do fator de crescimento epidérmico 2 (HER2). Além disso, avaliamos o seu potencial antitumoral in vitro, frente a linhagens de câncer de mama HER2 positivo. Isso porque, cerca de 20 a 30% dos cânceres de mama apresentam superexpressão HER2, os quais são caracterizados por serem invasivos e metastáticos. Nesse sentido, a formulação foi preparada por deposição interfacial de polímero pré-formado, seguido de revestimento com quitosana e complexação organometálica (utilizando Zn2+ como íon metálico) com trastuzumabe (LAP-LNC+-TRAS). A partir de um estudo de pré-formulação foi definida a concentração de anticorpo (200 μg mL-1) adequada para manter a estabilidade físico-química da partícula. Além disso, LAP-LNC+-TRAS apresentou formato esférico, com diâmetro médio <200 nm e baixa polidispersividade. O potencial zeta foi positivo, o teor de fármaco e a eficiência de encapsulação registrados foram próximos a 100%. A complexação do anticorpo à partícula foi verificada por cromatografia em papel. Modos vibracionais característicos das matérias-primas que compõem a formulação foram observados por FT-IR, além de alterações no entorno químico das partículas após a complexação com o anticorpo, demonstrando a interação do trastuzumabe com o sistema. In vitro, a formulação desenvolvida reduziu a viabilidade celular da linhagem SKBR3 (HER2 positivo). No ensaio de captação celular, a presença do anticorpo na superfície da partícula mostrou-se importante para o direcionamento e internalização do corante lipofílico incorporado às nanocápsulas. Embora a formulação desenvolvida tenha reduzido a viabilidade celular na linhagem HCC1954 (HER2 positiva, instrinsecamente resistente a inibidores de tirosina quinase) um efeito semelhante foi observado para formulações que não continham ditosilato de lapatinibe e trastuzumabe. O tratamento com LAP-LNC+-TRAS não alterou a expressão gênica de genes relacionados a morte celular por apoptose na linhagem HCC1954. Também verificamos que LAP-LNC+-TRAS é estável em fluidos gástrico e intestinal simulados, sendo que a presença do revestimento com quitosana foi importante para a manutenção do diâmetro de partícula. Esses achados abrem caminho para uma possível administração oral dessa partícula, além da via intravenosa. Em conclusão, demonstramos a viabilidade de obtenção da formulação LAP-LNC+-TRAS, ora inédita, e que apresenta a vantagem de combinar, em um mesmo nanocarreador, dois inibidores de HER2. Ademais, evidenciamos o potencial de LAP-LNC+-TRAS para o direcionamento ativo de fármacos e a sua ultização como uma possível estratégia para melhorar o tratamento do câncer de mama HER2 positivo. Consequentemente, esta partícula merece uma investigação mais aprofundada em novos estudos pré-clínicos.

Firstly, the objective of this thesis was to conduct a comprehensive bibliographic survey about the biological applications of lipid-core nanocapsules. This research resulted in a review article that includes important details on methodological factors that influence the physicochemical characteristics of lipid-core nanocapsules, their supramolecular structure, fluorescent labeling strategies, and surface modification. Subsequently, we developed multiwall lipid-core nanocapsules containing the drug lapatinib ditosylate and functionalized with trastuzumab antibody (LAP-LNC+-TRAS), both inhibitors of epidermal growth factor 2 (HER2) receptor type 2. Additionally, we evaluated their antitumor potential in vitro against HER2-positive breast cancer cells. This is because about 20 to 30% of breast cancers overexpressed HER2 and are characterized by being invasive and metastatic. In this sense, the formulation was prepared by interfacial deposition of preformed polymer, followed by coating with chitosan and organometallic complexation (using Zn2+ as metallic ion) with trastuzumab (LAP-LNC+-TRAS). Based on a pre-formulation study, the concentration of antibody (200 μg mL-1) appropriated to maintain the physicochemical stability of the particle was defined. Furthermore, the LAP-LNC+-TRAS exhibited a spherical shape, with an average diameter <200 nm and low polydispersity. The zeta potential was positive, the drug content and encapsulation efficiency recorded were close to 100%. The complexation of the antibody to the particle surface was confirmed by paper chromatography. FT-IR analysis revealed vibrational modes characteristic of the formulation's raw materials, and changes in the chemical environment of the particles after antibody complexation demonstrated the interaction between trastuzumab and the system. In vitro, the developed formulation reduced the cell viability of the SKBR3, a HER2-positive cell line. The presence of the antibody on the particle surface proved to be crucial for targeting and internalizing the lipophilic dye incorporated into the nanocapsules, as observed in the cellular uptake assay. Although the developed formulation reduced cell viability in the HCC1954 cell line (HER2 positive and intrinsically resistant to tyrosine kinase inhibitors), a similar effect was observed for formulations not containing lapatinib ditosylate and trastuzumab. Furthermore, treatment with LAP-LNC+-TRAS did not alter gene expression of genes related to cell death to apoptosis (HCC1954 cell line). We also verified that LAP-LNC+-TRAS is stable in simulated gastric and intestinal fluids, and the presence of the chitosan coating was important for the maintenance of the particle diameter. These findings present the possibility of oral administration of this particle, besides to the intravenous route. In conclusion, we demonstrate the feasibility of obtaining the LAP-LNC+-TRAS formulation, an innovative nanocarrier that combines two HER2 inhibitors whitin the same nanocarrier. Moreover, we demonstrate the potential of LAP-LNC+-TRAS for active drug targeting, highlighting its potential as a strategy for improving the treatment of HER2-positive breast cancer. Consequently, this particle warrants further investigation in pre-clinical studies.