Estudo de mecanismos envolvidos na neurofisiopatologia da deficiência da sulfito oxidase em ratos neonatos e jovens

Abstract

A deficiência da sulfito oxidase (SO) é uma condição de caráter autossômico recessivo que pode ser encontrada em duas formas: deficiência isolada da SO e deficiência do cofator molibdênio. A deficiência isolada da SO ocorre devido a mutações no gene SUOX, responsável por codificar a apoenzima da SO propriamente dita, levando à diminuição ou ausência de atividade, e posterior degradação da enzima. Já a segunda forma é causada pela deficiência na atividade de alguma das enzimas que participam da rota de biossíntese do cofator molibdênio. Visto que a enzima SO é responsável pela oxidação de sulfito a sulfato, ambas as formas são caracterizadas pelo acúmulo tecidual de sulfito e tiossulfato. Além disso, são clinicamente caracterizadas por convulsões neonatais graves, disfunção neurológica progressiva, hipotonia axial, hipertonicidade periférica e atraso no desenvolvimento psicomotor, o que comumente resulta em morte prematura. Considerando que a fisiopatologia do dano neurológico observado na deficiência da SO não está totalmente estabelecida, no primeiro capítulo desta tese foram investigados os efeitos in vivo do sulfito em estriado de ratos jovens sobre defesas antioxidantes, atividade da creatina cinase (CK), via das MAPK, e marcadores de apoptose. Também foi avaliada a influência do sequestrador de espécies reativas direcionado à mitocôndria JP4-039 sobre os efeitos tóxicos do sulfito. Para isso, ratos de 30 dias de vida receberam uma única dose intraestriatal de sulfito (Na2SO3; 2μmol; grupo teste) ou NaCl (2μmol; grupo controle), sendo eutanasiados 30 min após a injeção. Em outros grupos, os ratos receberam duas injeções intraperitoneais de JP4-039 (uma injeção de 3,5μg/g e outra de 5μg/g ou duas injeções de 5 μg/g), 24 e 2 horas antes da administração de sulfito ou NaCl. Após a eutanásia, o estriado foi removido e homogeneizado para as análises. O sulfito diminuiu as concentrações de glutationa reduzida (GSH) e as atividades das enzimas glutationa peroxidase (GPx), glucose-6-fosfato desidrogenase (G6PDH), glutationa redutase (GR), glutationa S-transferase (GST) e CK no estriado de ratos. O sulfito ainda aumentou o conteúdo proteico das enzimas superóxido dismutase-1 (SOD1) e catalase (CAT) e diminuiu o conteúdo da heme oxigenase-1 (HO1). Além disso, o sulfito diminuiu a fosforilação da p38 e aumentou a da ERK 1/2, não tendo efeito sobre a fosforilação da JNK. Em relação à sinalização de apoptose, o sulfito aumentou o conteúdo proteico da GSK-3β e da caspase-3 clivada. Por outro lado, o conteúdo da caspase- 9, Bcl-xL e α-sinucleína não foi alterado. O pré-tratamento com o JP4-039 preveniu a diminuição da atividade das enzimas antioxidantes e da CK. O JP4-039 também preveniu as alterações no conteúdo proteico da SOD1, CAT, HO1 e GSK-3β, assim como na fosforilação da p38 e ERK 1/2 e conteúdo da caspase-3. No segundo capítulo desta tese, investigamos os efeitos do tiossulfato, outro metabólito acumulado nas doenças com deficiência da SO, sobre parâmetros de homeostase redox e metabolismo energético em córtex cerebral e cerebelo de ratos neonatos. Para isso, ratos Wistar de 1 dia receberam, através de injeção intracerebroventricular, tiossulfato (0,5 μmol/g) ou PBS (veículo), sendo eutanasiados 30 minutos após a administração. Em córtex, o tiossulfato diminuiu as concentrações de GSH e a atividade das enzimas SOD, GST e CAT. Além disso, o metabólito aumentou a oxidação de DCFH. Em relação aos parâmetros de metabolismo energético, o tiossulfato reduziu a atividade do complexo II da cadeia transportadora de elétrons. Já em cerebelo, o tiossulfato, reduziu a atividade da enzima SOD e aumentou a atividade das enzimas GST e CAT. Além disso, aumentou o conteúdo de sulfidrilas e, assim como em córtex, de oxidação de DCFH. O tiossulfato também causou redução da atividade da enzima CK em cerebelo. Desta forma, pode ser presumido que o acúmulo tanto de sulfito como de tiossulfato tem importante papel na fisiopatologia da deficiência da SO uma vez que altas concentrações destes metabólitos induzem estresse oxidativo e disfunção energética além de, no caso do sulfito, causar morte celular. Ainda, foi visto que o JP4-039 pode ser uma importante alternativa terapêutica para melhorar o prognóstico dos pacientes portadores desse distúrbio.

Sulfite oxidase (SO) deficiency is an autosomal recessive condition that can manifest in two forms: isolated SO deficiency and molybdenum cofactor deficiency. Isolated SO deficiency occurs due to mutations in the SUOX gene, responsible for encoding the SO apoenzyme itself, leading to the decrease or absence of this activity, and subsequent degradation of the enzyme. The second form is caused by a deficiency in the activity of any enzyme that participates in the molybdenum cofactor biosynthesis route. Since the SO enzyme is responsible for the oxidation of sulfite to sulfate, both forms are characterized by tissue accumulation of sulfite and thiosulphate. Furthermore, they are clinically characterized by severe neonatal seizures, progressive neurological dysfunction, axial hypotonia, peripheral hypertonicity and psychomotor development delay, which commonly result in premature death. Considering that the pathophysiology of the neurological damage observed in SO deficiency is not fully established, the first chapter of this thesis investigated the in vivo effects of sulfite on antioxidant defenses, creatine kinase (CK) activity, MAPK pathway, and apoptosis markers in the striatum of young rats. The influence of the mitochondria-targeted reactive species scavenger JP4-039 was also evaluated on the possible toxic effects of sulfite. For this, 30-day-old rats received a single intrastriatal dose of sulfite (Na2SO3; 2μmol; test group) or NaCl (2μmol; control group), and were euthanized 30 min after the injection. In other groups, rats received two intraperitoneal injections of JP4-039 (one injection of 3.5μg/g and another of 5μg/g or two injections of 5μg/g), 24 and 2 hours before the administration of sulfite or NaCl. After euthanasia, the striatum was removed and homogenized for analysis. Sulfite decreased the concentrations of reduced glutathione (GSH) and the activities of the enzymes glutathione peroxidase (GPx), glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PDH), glutathione reductase (GR), glutathione S-transferase (GST) and CK in rat striatum. Sulfite also increased the protein content of the enzymes superoxide dismutase-1 (SOD1) and catalase (CAT) and decreased the content of heme oxygenase-1 (HO1). Furthermore, sulfite decreased p38 phosphorylation and increased that of ERK 1/2, with no effect on JNK phosphorylation. Regarding apoptosis signaling, sulfite increased the protein content of GSK-3β and cleaved caspase-3. On the other hand, the content of caspase-9, Bcl-xL and α-synuclein was not altered. Pre-treatment with JP4-039 prevented the decrease in the activity of antioxidant enzymes and CK. JP4-039 also prevented changes in SOD1, CAT, HO1 and GSK-3β protein content, as well as p38 and ERK 1/2 phosphorylation and caspase-3 content. In the second chapter of this thesis, we investigated the effects of thiosulphate, another metabolite accumulated in SO deficiency disorders, on parameters of redox homeostasis and energy metabolism in the cerebral cortex and cerebellum of newborn rats. For this, 1-day-old Wistar rats received, through intracerebroventricular injection, thiosulfate (0.5 μmol/g) or vehicle, and were euthanized 30 minutes after administration. In the cortex, thiosulphate decreased GSH concentrations and SOD, GST and CAT activities. Furthermore, it increased the oxidation of DCFH. Regarding the bioenergetics parameters, thiosulphate reduced the activity of the respiratory chain complex II. In the cerebellum, thiosulphate reduced the activity of SOD and increased the activity of GST and CAT. In addition, it increased the content of sulfhydryl groups and the oxidation of DCFH. Thiosulphate also caused a decrease in CK activity. Thus, it can be presumed that the accumulation of both sulfite and thiosulphate plays an important role in the pathophysiology of symptoms observed in SO deficiency, since high concentrations of these metabolites can exacerbate oxidative stress and cause energetic failure and, as seen with sulfite, cause cell death. In addition, we suggest that JP4-039 can be an important therapeutic alternative to improve the prognosis of patients with these disorders.