Efeito da hemina na proliferação e na diferenciação osteogênica de células mc3t3-e1

Abstract

A hemina, molécula oxidada do heme fisiologicamente presente no sangue, pode modular genes relacionados ao metabolismo do heme e influenciar na osteogênese durante a cicatrização óssea e a osseointegração dos implantes de titânio. Considerando tal potencial, o objetivo do estudo in vitro foi avaliar o efeito da hemina na proliferação e na diferenciação de células precursoras de osteoblastos. Para isso, cultivaram-se células MC3T3-E1 durante 3, 7 e 14 dias, em meio regular ou osteogênico suplementado ou não com hemina nas concentrações de 0 a 20 μg/ml. Nos respectivos tempos, foram verificadas a proliferação e a viabilidade celular através do teste de exclusão por Azul de Tripano; a diferenciação e mineralização através da mensuração da quantidade de Vermelho de Alizarina por espectrofotometria; e a migração celular, por meio de análise descritiva dos vídeos em Time Lapse de 24 horas. Os resultados foram comparados por ANOVA, com post hoc Tukey a 5% de significância. O comportamento da cultura diferiu para os grupos que receberam hemina a 5 µg/ml, com aumento da proliferação em 1,6 vezes em 7 dias e de 1,7 vezes em 14 dias. Para a diferenciação, o grupo tratado apenas com o meio osteogênico em 14 dias apresentou sinais de diferenciação e mineralização, enquanto o tratamento com o meio osteogênico associado às concentrações de hemina de 5 e 10 µg/ ml atrasou o início da fase de mineralização. As células suplementadas com hemina a 5 µg/ ml tiveram maior migração no meio de cultura em 24 horas do que as não-suplementadas. Concluiu-se que a suplementação com hemina em baixas concentrações como 5 µg/ ml teve promissores efeitos para a proliferação celular, não interferiu na diferenciação osteoblástica, mas postergou a fase de mineralização celular.

Hemin can influence osteogenesis during bone healing and osseointegration of titanium implants. This study aimed to verify whether medium supplementation with hemin promotes changes in the cell proliferation and differentiation processes. For this purpose, MC3T3-E1 osteoblastic precursor cells were cultured for 3, 7 and 14 days, in a regular medium, or osteogenic medium supplemented or not with hemin in the amounts from 0 to 20 μg/ ml. In the respective times, the cell proliferation and viability were verified through the Trypan Blue exclusion test; the cell differentiation and mineralization were analyzed by measuring the amount of Alizarin Red by spectrophotometry; and the cellular mobility was descriptively analyzed through 24-hour Time Lapse videos. The results were compared by ANOVA, with post hoc Tukey at 5% significance. The culture behavior differed for the groups that received 5 µg/ ml hemin, with greater proliferation, with an increase of 1.6 times after 7 days and 1.7 times after 14 days. Regarding the cell differentiation tests, there were significant differences in the osteogenic potential. The cells treated only with osteogenic medium continued to differentiate and initiated mineralization, while the cells treated with osteogenic medium associated with 5 or 10 µg/ ml of hemin presented a delay in the mineralization phase. The cells supplemented with hemin in 5 or 10 μg/ ml had greater mobility in the culture medium in 24 hours than the non-supplemented ones. It was concluded that supplementation with hemin at low doses such as 5µg/ ml had promising effects for the cell proliferation and did not interfere with the osteoblastic differentiation, but it postponed the phase of cell mineralization.