Seleção de isolados de Macrophomina phaseolina produtores de hidrolases e purificação parcial de complexos enzimáticos lipolíticos através de fracionamento com espuma

Abstract

Macrophomina phaseolina, fungo filamentoso fitopatogênico pertencente ao filo Ascomycota, apresenta ampla distribuição geográfica em climas quentes e secos. No Brasil, é encontrado do Nordeste até o Sul. Por causar sérias perdas na produção agrícola, é bastante estudado visando descobrir e combater seus mecanismos de patogenicidade. Porém, muito pouco se conhece quanto à sua capacidade para produzir biomoléculas – mais especificamente, enzimas - de potencial uso industrial. Treze isolados de M. phaseolina, coletados em diversas regiões brasileiras, foram cultivados em meio semi-sólido contendo diferentes substratos para determinar sua velocidade de crescimento radial e verificar a produção de hidrolases pectinolíticas, amilolíticas, proteolíticas e lipolíticas, com o objetivo de identificar aquele(s) de rápido crescimento em cada substrato e produtores da correspondente hidrolase. Dez isolados produziram todas as hidrolases verificadas. A velocidade de crescimento sobre pectina cítrica foi significativamente mais alta (p < 0,05) e a velocidade de crescimento sobre os diferentes substratos permitiu selecionar CMM 2105, CMM 1091 e PEL como os isolados de rápido crescimento sobre todos os substratos. A atividade lipolítica específica do isolado PEL, determinada a 37 ⁰C pH 8, foi significativamente mais elevada na comparação com outros três isolados após 96 h de cultivo em meio líquido contendo azeite de oliva, indicando o potencial de seus complexos lipolíticos para uso em detergentes fracamente alcalinos. O cultivo de CMM 2105, MMBF 0410 e PEL em meio líquido contendo azeite de oliva, sob diferentes pH, temperatura e tempo de incubação, indicou que MMBF 0410 apresentou a mais elevada atividade lipolítica e as melhores condições de cultivo foram 30 ⁰C, pH 5,5, com 72 h de incubação. Porém, quando MMBF 0410 foi cultivado sob as melhores condições em meio líquido contendo Tween 80, mostrou atividade lipolítica menor. A atividade dos caldos foi testada a 45 ⁰C, pH 8, por 30 min, evidenciando o potencial uso dos complexos lipolíticos em detergentes fracamente alcalinos em temperaturas médias. O sobrenadante de caldo de cultivo de MMBF 0410 em meio líquido contendo Tween 80 foi submetido ao fracionamento com espuma utilizando ar sob vários fluxos em estágios e adição escalonada de Triton X-100. As frações de espumado mais concentradas em complexos enzimáticos lipolíticos apresentaram atividade a 45 ⁰C, pH 8, recuperação e enriquecimento da atividade lipolítica de 45 % e 34,7, respectivamente, e purificação de 2,9. Foram detectadas lipases no espumado.

Macrophomina phaseolina, phylum Ascomycota, is a phytopathogenic fungus distributed worldwide in hot dry areas. In Brazil, it is found from the Northeast to the South region. It causes severe losses in crops production and is the subject of much research to discover and fight its pathogenic mechanisms. However, little is known about its capacity to produce biomolecules, specifically enzymes, of potential industrial use. Thirteen M. phaseolina isolates collected in different Brazilian regions were screened for fast-growth and the production of hydrolases of industrial interest. Hydrolase detection and growth rate determination were tested on citric pectin, gelatin, casein, soluble starch, and olive oil as substrates. Ten isolates were active on all substrates tested. The growth rate on pectin was significantly higher (P < 0.05), while the growth rates on the different media identified CMM 2105, CMM 1091, and PEL as the fastest growing isolates. Compared to other three isolates, the specific lipolytic activity of PEL was significantly higher at 96 h when cultivated in liquid medium containing olive oil. The broth was active at 37 ⁰C, pH 8, indicating potential use of its lipolytic enzymes in mild alkaline detergents. Isolates CMM 2105, MMBF 0410 and PEL, cultivated in liquid medium with olive oil, under different pH and incubation temperatures and time showed that the highest lipolytic activity was achieved with MMBF 0410 and the best conditions were 30 ⁰C, pH 5.5, with 72 h of incubation. Activities of the broths were tested at 45 ⁰C, pH 8 for 30 min, evidencing the potential use of the lipolytic complexes in mild alkaline detergents at medium temperature range. However, when MMBF0410 was cultured under these same best conditions in liquid medium with Tween 80 a lower level of lipolytic activity developed. Culture supernatant of MMBF 0410 cultivated in liquid medium with Tween 80 was submitted to foam fractionation with air using several gas flows in stages and stepwise addition of Triton X-100. The most concentrated foamate fractions displayed lipolytic activity at 45 ⁰C, pH 8, activity recovery and enrichment of 45 % and 34.7, respectively, and purification of 2.9. Lipases were present in the foamate.