Caracterização de proteínas mediadoras da sinalização de cálcio no patógeno Cryptococcus neoformans

Abstract

Cryptoccocus neoformans é um fungo patogênico e oportunista que acomete principalmente pacientes imunocomprometidos, responsável por quadros de pneumonia e meningite. Para tanto, as células fúngicas devem se adaptar ao ambiente do hospedeiro pela expressão de diversos determinantes de virulência. A regulação desses determinantes pode ocorrer por intermédio de sinais de cálcio (Ca2+), o qual é capaz de ativar a via de sinalização mediada por calcineurina, necessária para a patogênese C. neoformans. Ainda, a manutenção da homeostase intracelular de Ca2+ nesse patógeno é imprescindível para os mecanismos de virulência, sendo regulada por transportadores de Ca2+ , como Pmc1 e Vcx1. Na presente Tese, exploramos o papel de outras proteínas componentes da sinalização e da manutenção da homeostase de Ca2+ em C. neoformans. A caracterização da atividade da proteína ortóloga Ncs1 (neuronal calcium sensor) revelou a influência de uma proteína ligadora de Ca2+ na adaptação de C. neoformans ao hospedeiro. Nossos dados demonstraram que Ncs1 é necessário para a tolerância e regulação da homeostase de Ca2+, sendo a expressão de NCS1 positivamente regulada pela via da calcineurina. Ncs1 é essencial para o aparecimento do broto, divisão celular adequada, e correta expressão gênica de reguladores da progressão de ciclo celular. Ncs1 é indispensável para o desenvolvimento de C. neoformans em condições fisiológicas e para o estabelecimento da criptococose em um modelo de infecção in vivo. A proteína Ncs1 é sensora e responsiva a Ca2+ e, conjuntamente com a via da calcineurina, regula a adaptação ao hospedeiro e virulência de C. neoformans. Além disso, buscamos caracterizar fatores de transcrição que sejam responsivos a sinais de Ca2+. Para tanto, investigamos uma biblioteca de mutantes nulos para fatores de transcrição de C. neoformans, a fim de identificar aqueles com alterações nos níveis intracelulares de Ca2+. A partir disso, duas proteínas foram selecionadas: Sre1 e Hob1, os quais são reguladores da síntese de ergosterol. Reforçando a relação entre estes fatores de transcrição e a sinalização mediada por Ca2+ , identificamos que a disponibilidade de Ca2+ é capaz de diminuir a sensibilidade de C. neoformans a antifúngicos azólicos. Adicionalmente, demonstramos que Ca2+ modula a síntese de ergosterol a nível transcricional.

Cryptococcus neoformans is an opportunistic pathogenic fungus that provokes disease mainly in immunocompromised patients, provoking pneumonia and meningoencephalitis. For that, the yeast cells must cope with the harsh host environment through the expression of several virulence determinants. The regulation of those determinants can be mediated by calcium (Ca2+) signals that are capable to activate the calcineurin signaling pathway, which by its turn is needed for cryptococcal pathogenesis. Besides, the intracellular Ca2+ homeostasis in this fungus is essential to the virulence mechanism and is regulated by Ca2+ transporters such as Pmc1 and Vcx1. In this Thesis we explored the role of other proteins participants on the Ca2+ signaling and homeostasis maintenance in C. neoformans. The characterization of the ortholog protein activity Ncs1 (neuronal calcium sensor) revealed the influence of a Ca2+ binding protein in C. neoformans adaptation to host. Our data demonstrated that Ncs1 is needed for tolerance and regulation of Ca2+ homeostasis; still, we verified that the expression of NCS1 is positively regulated by calcineurin pathway. Ncs1 is essential to the bud emmergence, adequate cell division pattern, and correct gene expression of cell cycle regulators. Ncs1 is indispensable for C. neoformans development in host conditions and the establishment of the disease in an in vivo model of infection. The Ncs1 is a sensor Ca2+ protein, that collectively with the calcineurin pathway regulates the host adaptation and virulence of C. neoformans. Furthermore, we sought to characterize transcription factors that are responsive to Ca2+ signals. For that, we investigated a mutant knockout library for transcription factors of C. neoformans, aiming to identify those mutants with altered intracellular Ca2+ levels. From that, two proteins were selected: Sre1 and Hob1, which are regulators of the sterol biosynthesis pathway. Reinforcing this relation between the transcription factors of the sterol synthesis and the Ca2+ signaling, our data suggest that Ca2+ availability can diminish C. neoformans susceptibility to azoles. Further, we demonstrate that Ca2+ can regulate ergosterol synthesis at the transcriptional level.