O estudo da enzima deidroquinato sintase de Mycobacterium tuberculosis H37Rv como alvo para o desenvolvimento de fármacos antituberculose

Abstract

Apesar da incidência per capita da tuberculose (TB) ter se mantido estável em 2005, o número de novos casos que surgem a cada ano continua a aumentar no mundo todo. De acordo com a Organização Mundial de Saúde, foram estimados 9,4 milhões de novos casos de TB em 2008, dos quais 1,4 milhões eram HIV - positivos, e com 1,8 milhões de mortes - o equivalente a 4.500 mortes por dia. Fatores como migração, privação sócio-econômica, co-infecção TB-HIV e o aparecimento de cepas resistentes contribuíram para o aumento do número de casos de TB no mundo, principalmente nos países onde a TB já foi considerada erradicada, e criaram a necessidade do desenvolvimento de novas terapêuticas. Alvos moleculares específicos, que são essenciais para o patógeno, e ausentes no hospedeiro, como as enzimas da via do ácido chiquímico são alvos atraentes para o desenvolvimento de novas drogas antituberculose. Essa via leva à síntese de compostos aromáticos, como aminoácidos aromáticos, e é encontrada em plantas, fungos, bactérias e parasitas do phylum Apicomplexa, mas está ausente em humanos. No ano de 2000, foi comprovada a essencialidade dessa via para a viabilidade do bacilo, tornando todas essas enzimas alvos validados para estudo. A segunda enzima da via, deidroquinato sintase (DHQS), catalisa a conversão de 3-deoxi-D-arabino heptulosonato-7-fosfato em 3-deidroquinato, o primeiro composto cíclico. Neste trabalho, são descritos o requerimento de metais divalentes na reação e a determinação do mecanismo cinético da DHQS. Os parâmetros cinéticos verdadeiros foram determinados e, juntamente com os experimentos de ligação, o mecanismo rápido-equilíbrio aleatório foi proposto. O tratamento com EDTA aboliu completamente a atividade de DHQS, sendo que a adição de Co+2 e Zn+2 levam a recuperação total e parcial da atividade enzimática, respectivamente. O excesso de Zn+2 inibe a atividade DHQS, e os dados de ITC indicaram a presença de dois sítios seqüenciais de ligação, o que é consistente com a existência de um sítio secundário inibitório. O protocolo de cristalização foi estabelecido e experimentos em andamento proporcionarão a elucidação da estrutura tridimensional da DHQS, que irá beneficiar tanto o desenho de novos inibidores como uma análise detalhada dos rearranjos do domínio da proteína. Em conjunto, estes resultados representam um passo essencial para o desenho racional de inibidores específicos que podem fornecer uma alternativa promissora para um novo, eficaz, e mais curto de tratamento para TB.

Although the estimated per capita tuberculosis (TB) incidence was stable in 2005, the number of new cases arising each year is still increasing globally. According with World Health Organization, there were estimated 9.4 million new TB cases in 2008, from which 1.4 million were HIV-positive, with 1.8 million deaths total – equal to 4500 deaths a day. Migration, socio-economic deprivation, HIV co-infection and the emergence of extensively-resistance strains, have all contributed to the increasing number of TB cases worldwide, mainly in countries where it was once considered eradicated, and have created an urgent need for the development of new therapeutics against TB. Specific molecular targets, that are essential to the pathogen, and absent in the host, like the enzymes of the shikimate pathway, are attractive targets to development of new antitubercular drugs. This pathway leads to the biosynthesis of aromatic compounds, including aromatic amino acids and it is found in plant, fungi, bacteria and Apicomplexa parasites, but is absent in humans. In 2000, this pathway was proved to be essential to the viability of the pathogen, which validates all its enzymes as potential targets. The second enzyme of this pathway, dehydroquinate synthase (DHQS), catalyzes the conversion of 3-deoxy-D-arabinoheptulosonate 7-phosphate in 3-dehydroquinate, the first cyclic compound. In this work, we described the metal requirement and kinetic mechanism determination of the dehydroquinate synthase. The determination of the true kinetic parameters was performed, and, in addition to ligand binding experiments, the rapid-equilibrium random mechanism was determined. The treatment with EDTA abolished completely the activity of DHQS, and the addition of Co+2 and Zn+2 leads to full and partial recovery of enzyme activity, respectively. Excess of Zn+2 inhibits the DHQS activity, and the ITC data revealed two sequential binding sites, which is consistent with the existence of a secondary inhibitory site. The crystallization protocol was established and ongoing experiments will provide the three-dimensional structure of mtDHQS, which will benefit both the design of novel inhibitors as well as detailed analysis of domain rearrangements of protein. Taken together, these results represent an essential step for the rational design of specific inhibitors that can provide a promising alternative to a new, effective, and shorter treatment for TB.