Comparação entre cultivo e detecção molecular para diagnóstico de dermatófitos diretamente do pelame de cães e de gatos

Abstract

Os dermatófitos são responsáveis pela doença fúngica mais frequente na clínica médica veterinária de pequenos animais: a dermatofitose. Trata-se de uma zoonose de distribuição mundial, caracterizada pela infecção de estruturas queratinizadas, como pele, cabelos, pelame, unhas e garras. O cultivo micológico é o padrão de referência para o diagnóstico dessa micose, no entanto requer aproximadamente 15 dias para um resultado definitivo. Métodos de diagnóstico moleculares baseados em PCR possuem elevada sensibilidade e especificidade, além de proporcionarem resultados entre um a três dias. O objetivo deste estudo foi realizar a detecção molecular de dermatófitos diretamente de amostras de pelame de cães e de gatos com suspeita de dermatofitose e comparar os resultados obtidos com o método padrão de referência. Foram coletadas 219 amostras de pelame, as quais foram submetidas ao cultivo micológico e à extração de DNA para realização de análise por qPCR. A comparação entre testes mostrou concordância de resultados em 70% das amostras: a qPCR identificou corretamente amostras positivas em cultivo em 34% dos casos, enquanto identificou corretamente amostras negativas em cultivo em 95% dos casos. Além disso, a qPCR foi capaz de detectar dermatófitos em sete amostras negativas em cultivo. A qPCR detectou maior proporção de dermatófitos em amostras de gatos (20%) do que em amostras de cães (13%). Diferentes métodos prévios à extração de DNA (tratamento por congelamento versus sem tratamento) e uso de amostras com diferentes períodos entre coleta e extração de DNA (menor ou igual a um ano versus maior que um ano) foram comparados, observando-se que o uso de amostras frescas associado ao tratamento por congelamento prévio à extração de DNA proporcionou 64% de positividade na qPCR das amostras positivas em cultivo. Ainda, amostras de alta pureza e concentração de DNA apresentaram 82% de positividade na qPCR das amostras positivas em cultivo. A qPCR pode ser utilizada como um teste de triagem inicial prévio ao cultivo micológico. Ainda assim, a técnica molecular desenvolvida deve ser adaptada com a adição de novos métodos juntos à extração a fim de aumentar sua eficácia, podendo se tornar o método de escolha para a detecção de dermatófitos em amostras clínicas no futuro.

Dermatophytes are responsible for the most common fungal disease in small animal veterinary practice: dermatophytosis. It is a worldwide zoonosis characterized by infection of keratinized structures such as skin, hair, fur, nails and claws. Mycological culture is the reference standard for diagnosis of this ringworm, however it requires at least 15 days for a definitive result. PCR-based diagnostic methods are high sensitivity and specificity and provide results within one to three days. The aim of this study was to perform molecular detection of dermatophytes directly from dog and cat fur samples with suspected dermatophytosis and to compare results with reference standard method. A total of 219 fur samples were collected and submitted to mycological culture and DNA extraction for qPCR analysis. Comparison between tests showed results agreement in 70% of samples: qPCR correctly identified positive samples in culture in 34% of cases; while correctly identified negative culture samples in 95% of cases. In addition, qPCR was able to detect dermatophytes in seven negative culture samples. qPCR detected a higher proportion of dermatophytes in cat (20%) than in dog (13%) samples. Different methods prior to DNA extraction (freezing treatment versus untreated) and use of samples with different periods between DNA collection and extraction (less than or equal to one year versus more than one year) were compared: use of fresh samples associated with freezing treatment prior to DNA extraction yielded 64% positivity in qPCR of positive samples in culture. Also, high purity and high amount of DNA samples yielded 82% positivity in qPCR of positive samples in culture. qPCR can be used as initial screening test prior to mycological culture. Nevertheless, this molecular technique developed must be adapted with addition of new methods together with extraction in order to increase its effectiveness and could become the method of choice for dermatophytes detection in clinical samples in future.