Ativação da via AGE-RAGE e sua interação com microRNAs propostos como reguladores-chave da imunossenescência no contexto da obesidade

Abstract

Introdução: A imunossenescência é caracterizada por um status pró-inflamatório sistêmico crônico e pela redução da capacidade celular de lidar com stress, características comumente presentes no envelhecimento fisiológico e também na obesidade. O perfil pró-inflamatório sistêmico observado na obesidade tem relação com a indução de senescência em células saudáveis, porém, os mecanismos envolvidos no estabelecimento desse fenótipo ainda não são bem compreendidos. Objetivo: Investigar mecanismos envolvidos no estabelecimento da imunossenescência em células mononucleares de sangue periférico (PBMC) de pacientes portadores de obesidade, analisando uma rede de interação contendo proteínas e microRNAs importantes para este fenótipo. Metodologia e resultados: Inicialmente, foi realizada a construção de uma lista de genes relacionados à imunossenescência a partir da intersecção entre os termos ontológicos “inflammatory response” e “aging” obtidos a partir da base de dados Gene Ontology, onde foram encontrados 39 genes envolvidos simultaneamente com ambos os termos. Então, passamos a investigar os microRNAs capazes de regular por complementariedade os genes envolvidos na imunossenescência em 8 bases de dados diferentes. A partir dessa lista foram selecionados como nodos centrais para a regulação da rede os microRNAs realizando 18 ou mais interações com os genes envolvidos no fenótipo imunossenescente para posterior validação: hsa-miR-214-3p, hsa-miR-3163, hsa-miR-369-3p, hsa-miR-374b-5p, hsa-miR-495-3p, hsa-miR-520f, hsa-miR-548c-3p, hsa-miR-548-3p. Foi realizada ainda uma análise de enriquecimento de via utilizando o software ConsensusPathDB para os 39 genes envolvidos na imunossenescência, onde a via de sinalização AGE-RAGE se mostrou a mais enriquecida (P = 1,14e-12). A validação desses dados via qRT-PCR em PBMC de pacientes portadores de obesidade e controles eutróficos demonstrou uma redução na expressão de miR-374-5p (P = 0,0386) e similaridade na expressão de miR-214-3p entre os grupos. Ao analisarmos componentes da via AGE-RAGE em PBMC de pacientes portadores de obesidade, observamos um aumento significativo na expressão proteica de RAGE (P = 0,0075), na expressão gênica de STAT3 (P = 0,0369) e na fosforilação de NFkB (P = 0,0052) e p38 (P < 0,0001). Conclusões: As análises de bioinformática apontaram para 8 microRNAs centrais na regulação da imunossenescência e para via AGE-RAGE como a mais enriquecida nesse fenótipo. Proteínas e microRNAs indicados pelas análises de bioinformática como relevantes na regulação da imunossenescência estavam de fato alterados em PBMC de pacientes portadores de obesidade, demonstrando a capacidade do nosso modelo in silico de prever fenômenos biológicos relevantes (CAAE: 26793114.0.0000.5347).

Introduction: Immunosenescence is characterized by an increased systemic proinflammatory status and by a compromised capacity of the cell to cope with stress, features commonly associated with physiological aging and also with obesity. The systemic proinflammatory observed in obesity is related to senescence induction in healthy cells, however, the mechanisms involved in this phenotype establishment are not yet understood. Thus, the aim of this work is to investigate the mechanisms involved on the immunosenescence establishment on peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from obese patients, analyzing a network containing proteins and microRNAs relevant for this phenotype. Methods and results: First, it was built a list containing genes related to immunosenescence from the intersection between the ontological terms “inflammatory response” and “aging”, acquired from the database Gene Ontology, were we found 39 genes involved simultaneously with both terms. Then we started to investigate microRNAs capable of regulating by complementarity those genes involved on immunosenescence in 8 different databases. From that list, were selected as central regulatory nodes the microRNAs performing at least 18 interactions with genes involved on the immunosenescent phenotype for posterior validation: hsa-miR-214-3p, hsa-miR-3163, hsa-miR-369-3p, hsa-miR-374b-5p, hsa-miR-495-3p, hsa-miR-520f, hsa-miR-548c-3p, hsa-miR-548-3p. It was performed also an enrichment pathway analysis through ConsensusPathDB software for the 39 genes involved on immunosenescence, were the most enriched signaling pathway was AGE-RAGE (P = 1.14e-12). Data validation via qRT-PCR in PBMC from obese patients and eutrophic controls showed a reduction on miR-374-5p expression (P = 0.0386) and similar expression for miR-214-3p between groups. When we analyzed the AGE-RAGE pathway components, we observed an increased protein expression of RAGE (P = 0.0075), on gene expression of STAT3 (P = 0.0369) and also in NFkB (P = 0.0052) and P38 (P < 0.0001) phosphorylation in PBMC from patients with obesity. Conclusions: Bioinformatics pointed out 8 central microRNAs for immunosenescence regulation and the AGE-RAGE as the more enriched pathway in this phenotype. Proteins and microRNAs proposed by bioinformatic analyses as relevant for immunosenescence regulation were in fact altered in PBMC from patients with obesity, demonstrating the efficiency of our in silico model in predicting relevant biological phenomena (CAAE: 26793114.0.0000.5347).