Estudo dos mecanismos inflamatórios e de dano oxidativo em pacientes portadores de Niemann-Pick tipo C : efeito in vivo do miglustate e in vitro de β-ciclodextrina nanoparticulada, N-acetilcisteína e coenzima Q10

Abstract

Niemann-Pick tipo C (NP-C) é uma doença lisossômica de depósito, causada por disfunção nas proteínas NPC1 ou NPC2, responsáveis pelo tráfego de lipídeos intracelular. Alterações genéticas em uma dessas proteínas resulta em acúmulo de colesterol não-esterificado e de glicoesfingolipídeos dentro do compartimento endossomal/lisossomal das células de pacientes afetados. Alguns estudos na literatura vêm relacionando o estresse oxidativo e a inflamação à fisiopatologia dessa doença, entretanto, por se tratar de uma doença genética rara, poucos estudos investigam como funcionam esses mecanismos deletérios em pacientes. Além disso, pouco se sabe sobre o efeito do tratamento com miglustate (N-butil-desoxinojirimicina) sobre o estresse oxidativo e inflamação, além da correlação com a melhora no dano neurológico observado nesses pacientes. Considerando que os marcadores de estresse oxidativo e inflamação tem se mostrado alvos importantes em doenças de acúmulo lisossomal e considerando que a NP-C não possui cura e nem tratamento satisfatório, objetivamos analisar esses parâmetros em pacientes durante o tratamento com miglustate com o intuito de melhor compreender a fisiopatologia da doença e futuros alvos terapêuticos. Foram avaliados parâmetros de dano ao DNA, produção de citocinas, estresse oxidativo, assim como marcadores plasmáticos de dano neurológico. Além disso, também foram investigados os efeitos in vitro da β-ciclodextrina nanoparticulada (NS β-CD) e dos antioxidantes N-Acetilcisteína (NAC) e Coenzima Q10 (CoQ10), em células de pacientes, no acúmulo de colesterol, nos parâmetros de estresse oxidativo, dano mitocondrial e na produção de citocinas. No primeiro capítulo desta tese encontramos um aumento na produção de citocinas pró e anti-inflamatórias em pacientes NP-C no momento do diagnóstico, bem como um efeito benéfico do miglustat ao diminuir as citocinas IL-1β, IL-6, IL-10 e TNF-α, nos pacientes NP-C tratados. Já no segundo capítulo mostramos que o estresse oxidativo e nitrativo pode estar a contribuir para a fisiopatologia da NP-C, pois os níveis de lipoperoxidação e os níveis de nitrito e nitrato estavam aumentados nesses pacientes quando comparados a indivíduos saudáveis, assim como o dano ao DNA. As nanopartículas contendo β-CD reduziram o colesterol acumulado nos fibroblastos NP-C. Este resultado foi potencializado pelo uso concomitante das nanopartículas com os antioxidantes NAC e CoQ10 em comparação com fibroblastos de indivíduos saudáveis. Além disso, tratamentos combinando nanopartículas de β-CD e antioxidantes podem reduzir o estresse oxidativo mitocondrial, demonstrando vantagens em relação ao β-CD livre. No terceiro capítulo verificamos uma redução dos níveis de dois dos marcadores plasmáticos de neurodegeneração avaliados (PAI-1 e PDGF-AA) em pacientes NP-C, além da normalização dos níveis de BDNF, NCAM, PFGF-AB/BB e Catepsina D. Com a análise molecular dos pacientes estudados no capítulo cinco, identificamos quatro variantes patogênicas previamente descritas, bem como um mesmo padrão de SNPs para os 2 pacientes que possuem a mesma variante. Isso nos leva a crer que essa mutação pode ter uma origem comum, visto que esses indivíduos não relacionados apresentam os mesmos polimorfismos. Nos ensaios in vitro realizados no quarto capítulo, encontramos um benefício no tratamento com NAC e CoQ10, através da redução do acúmulo de colesterol e da mitigação do dano ao DNA em fibroblastos de pacientes NP-C tratados com estes antioxidantes em comparação aos fibroblastos não tratados. Estas moléculas podem atuar reduzindo ou prevenindo a formação de espécies reativas, protegendo os ácidos nucléicos dos danos oxidativos. Os ensaios in vitro demostraram que há um efeito positivo do tratamento com antioxidantes, apesar dos mecanismos ainda não estarem claros. Os resultados obtidos nos permitem concluir que há envolvimento do dano oxidativo, da inflamação e da neurodegeneração na fisiopatologia da NP-C, e que, tanto o miglustate quanto a NSβ-CD, NAC e CoQ10, possuem efeitos protetores nestes processos.

Niemann-Pick type C (NP-C) is a lysosomal storage disease caused by dysfunction in NPC1 or NPC2 proteins, responsible for intracellular lipid traffic. Genetic alterations in one of these proteins result in the accumulation of unesterified cholesterol and glycosphingolipids within the endosomal/lysosomal compartment of the cells of affected patients. Some studies in the literature have linked oxidative stress and inflammation to the pathophysiology of this disease, however, as it is a rare genetic disease, few studies investigate how these deleterious mechanisms work in patients. In addition, little is known about the effect of miglustat (N-butyl-deoxynojirimycin) treatment on oxidative stress and inflammation, in addition to the correlation with the improvement in neurological damage observed in these patients. Considering that markers of oxidative stress and inflammation have been shown to be important targets in lysosomal accumulation diseases and considering that NP-C has no cure or satisfactory treatment, we aimed to analyze these parameters in patients during treatment with miglustat in order to better understand the disease pathophysiology and future therapeutic targets. DNA damage parameters, cytokine production, oxidative stress, as well as plasma markers of neurological damage were evaluated. In addition, in vitro effects of β-cyclodextrin nanoparticulated and antioxidants N-Acetylcysteine (NAC) and Coenzyme Q10 (CoQ10) in patient cells, on cholesterol accumulation, on oxidative stress parameters, mitochondrial damage and cytokine production were also investigated. In the first chapter of this thesis, we found an increase in the production of pro and anti-inflammatory cytokines in NP-C patients at the time of diagnosis, as well as a beneficial effect of miglustat by decreasing the cytokines IL-1β, IL-6, IL-10 and TNF-α, in treated NP-C patients. In the second chapter, we showed that oxidative and nitrative stress may be contributing to the pathophysiology of NP-C, since the levels of lipid peroxidation and nitrite and nitrate were increased in these patients when compared to healthy individuals, as well as high damage to the DNA. The nanoparticles containing β-CD reduced the cholesterol accumulated in the NP-C fibroblasts. This result was potentiated by the concomitant use of nanoparticles with the antioxidants NAC and CoQ10 in comparison with fibroblasts from healthy individuals. Furthermore, treatments combining β-CD nanoparticles and antioxidants can reduce mitochondrial oxidative stress, demonstrating advantages over free β-CD. In the third chapter, we verified a reduction in the levels of two of the neurodegeneration plasma markers evaluated (PAI-1 and PDGF-AA) in NP-C patients, in addition to the normalization of BDNF, NCAM, PFGF-AB/BB and Cathepsin D levels. With the molecular analysis of the patients studied in chapter five, we identified four previously described pathogenic variants, as well as the same pattern of SNPs for the 2 patients who have the same variant. This leads us to believe that this mutation may have a common origin, since these unrelated individuals have the same polymorphisms. In the in vitro assays carried out in the fourth chapter, we found a benefit in the treatment with NAC and CoQ10, through the reduction of cholesterol accumulation and the mitigation of DNA damage in fibroblasts from NP-C patients treated with these antioxidants compared to untreated fibroblasts. These molecules can act by reducing or preventing the formation of reactive species, protecting nucleic acids from oxidative damage. In vitro assays have shown that there is a positive effect of treatment with antioxidants, although the mechanisms are still unclear. The results obtained allow us to conclude that oxidative damage, inflammation, and neurodegeneration are involved in the pathophysiology of NP-C, and that miglustat or the in vitro treatments with NS β-CD, NAC and CoQ10 have protective effects on these processes.