Caracterização genômica (taxonomia e simbiose) e fenotípica (controle biológico de fitopatógenos) de bactérias isoladas de feijoeiro da Coleção SEMIA : revisão taxonômica da Ordem Rhizobiales (Hyphomicrobiales)

Abstract

A Coleção SEMIA existe oficialmente desde 1975 e é referência internacional na área de inoculantes. Essa coleção mantém mais de 1.200 estirpes de bactérias isoladas de nódulos de 171 leguminosas de importância agrícola, das quais 98 são recomendadas para o uso em inoculantes. Grande parte da Coleção SEMIA foi identificada utilizando características bioquímicas, PCR baseada em elementos repetitivos, identificações sorológicas e de planta hospedeira, e, menor número, o sequenciamento parcial do gene do 16S rRNA. Entretanto, ainda faltam informações taxonômicas das estirpes SEMIA, com base nos métodos moleculares baseados em análise de genomas aceitos atualmente. Em vista disso, o presente trabalho se propôs a i) elucidar o potencial das estirpes SEMIA para o controle biológico de fungos patogênicos e ii) resolver problemas de taxonomia dentro da Coleção SEMIA e da própria ordem Rhizobiales (Hyphomicrobiales). O capítulo I, “Rhizobia for biological control of plant diseases”, é uma revisão sobre os mecanismos empregados para a eficácia dos rizóbios no biocontrole de doenças causadas por diferentes classes de fitopatógenos. O capítulo II, intitulado “Rhizobium strains in the biological control of the phytopathogenic fungi Sclerotium (Athelia) rolfsii on the common bean” é um artigo de pesquisa que avaliou 78 isolados de feijão da coleção de cultura SEMIA para identificar agentes de biocontrole contra o fitopatógeno S. rolfsii. Demonstramos que estirpes estirpes isoladas de nódulos podem ser fortes antagonistas ao crescimento S. rolfsii e ser eficazes no controle da doença provocada pelo mesmo à campo. No Capítulo III, “Reclassification of Ochrobactrum lupini as a later heterotypic synonym of Ochrobactrum anthropi based on whole-genome sequence analysis”, demonstramos com dados filogenéticos, genômicos, fenotípicos e quimiotaxonômicos que O. lupini deve ser considerado a mesma espécie de O anthropi. O Capítulo IV, “Genomic metrics applied to Rhizobiales (Hyphomicrobiales): species reclassification, identification of unauthentic genomes and false type strains”, apresenta a taxonomia atualizada da ordem Hyphomicrobiales, com base em 270.400 comparações analisadas com um corte de 95% de ANI para extrair clusters de genoma com alta identidade através do uso da ferramenta ProKlust descrita. Esse trabalho originou uma série de propostas de reclassificações taxonômicas, além da descoberta de acessos de genoma que não era das estirpes-tipo genuínas utilizadas para as respectivas descrições de “suas espécies”, bem como casos de uso indevido do termo “estirpe-tipo” no banco de dados. No Capítulo IV, "Analysis of 95+ genomes from the common-bean branch from SEMIA collection: new genomospecies, alternative nitrogenases, horizontal gene transfer events, and unexpected genera of nodule-associated bacteria", sequenciamos os genomas de 96 estirpes SEMIA, relatando 15 clusters de genoespécies, bem como, 12 genoespécies isoladas, que surgiram de 1.322.500 comparações de ANI em pares entre as estirpes SEMIA e 1.053 genomas pertencentes a Burkholderiaceae, Comamonadaceae, Mycobacteriaceae, Rhizobiaceae, e Xanthomonadaceae. As estirpes foram identificadas como pertencentes a nove espécies diferentes de Rhizobium, Agrobacterium radiobacter, Pararhizobium giardinii, Paraburkholderia fungorum e as espécies putativas associadas a nódulos Mycobacterium monacense, Stenotrophomonas maltophilia e Variovorax guangxiensis. Cerca de um terço da coleção foi identificado como novas espécies potenciais. A análise do pangenoma das estirpes SEMIA resultou em 50.221 clusters de genes contendo 604.752 genes. A presença de genes relacionados às nitrogenases alternativas foi detectada entre representantes pertencentes a M. monacense, P. fungorum e V. guangxiens, bem como nas novas espécies putativas G11 e G9. A presença de homólogos nifH foi exclusiva para 55 estirpes pertencentes a Rhizobium. A detecção de sobreposição com sequências extracromossômicas foi encontrada apenas entre representantes de Rhizobium e P. fungorum. Vários genes de transposase foram localizados a montante e a jusante dos operons nifHDKENX e nifHDKE detectados, indicando eventos de transferência horizontal. Uma ampla distribuição filogenética foi encontrada no nível da família e um número notável (≥40) de genes transferidos putativos foram encontrados especialmente entre 12 estirpes, incluindo eventos de transferência putativos de outros domínios, como a família botânica Euphorbiaceae, Aspergillaceae e Siphoviridae. Conjuntos de genes biossintéticos putativos foram identificados. A reclassificação de mais de 25 espécies bacterianas também foi proposta com base nas comparações entre os genomas das estirpes-tipo.

The SEMIA Collection has officially existed since 1975 and is an international reference in the field of inoculants. This collection holds more than 1,200 strains of bacteria isolated from the nodules of 171 legumes of agricultural importance, 98 of which are recommended for use in inoculants. A large part of the SEMIA Collection was identified using biochemical characteristics, PCR based on repetitive elements, serological and host plant identification, and, to a lesser extent, the partial sequencing of the 16S rRNA gene. However, taxonomic information on SEMIA strains is still lacking, based on currently accepted molecular genome-based methods. In view of this, the present work aimed to i) elucidate the potential of SEMIA strains for the biological control of pathogenic fungi and ii) solve taxonomy problems within the SEMIA Collection and the order Rhizobiales (Hyphomicrobiales) itself. Chapter I, “Rhizobia for biological control of plant diseases”, is a review regarding rhizobial mechanisms and efficacy to biocontrol diseases caused by different classes of plant pathogens. Chapter II, entitled “Rhizobium strains in the biological control of the phytopathogenic fungi Sclerotium (Athelia) rolfsii on the common bean” is a research article that evaluated 78 common bean isolates from SEMIA culture collection to identify biocontrol agents against the plant pathogen S. rolfsii. We demonstrated that root-isolated strains can be strong antagonists to S. rolfsii growth and be effective in controlling the disease caused by this pathogen in the field. In the Chapter III, “Reclassification of Ochrobactrum lupini as a later heterotypic synonym of Ochrobactrum anthropi based on whole-genome sequence analysis”, we demonstrated with phylogenetic, genomic, phenotypic, and chemotaxonomic data that O. lupini should be considered the same species of O. anthropi. The Chapter IV, “Genomic metrics applied to Rhizobiales (Hyphomicrobiales): species reclassification, identification of unauthentic genomes and false type strains”, presents the updated taxonomy of the order Hyphomicrobiales, based on 270,400 comparisons analyzed with a 95% ANI cut-off to extract high identity genome clusters using the described ProKlust tool. This work has led to a series of proposals for taxonomic reclassifications, in addition to discover of genome accessions that are not from the genuine type strains used for the respective species descriptions as well as cases of misuse of the term “type strain”. In the Chapter IV, “Analysis of 95+ genomes from the common-bean branch from SEMIA collection: new genomospecies, alternative nitrogenases, horizontal gene transfer events, and unexpected genera of nodule-associated bacteria”, we sequenced the genomes from 96 SEMIA strains, reporting 15 genospecies clusters as well as 12 isolated genospecies that arised from the 1,322,500 ANI pairwise comparisons between the SEMIA strains and 1,053 genomes belonging to Burkholderiaceae, Comamonadaceae, Mycobacteriaceae, Rhizobiaceae, and Xanthomonadaceae. The strains were identified as belonging to nine different Rhizobium species, Agrobacterium radiobacter, Pararhizobium giardinii, Paraburkholderia fungorum and the putative nodule-associated species Mycobacterium monacense, Stenotrophomonas maltophilia, and Variovorax guangxiensis. Around one-third of the collection were identified as new potential species. The pangenome analysis of SEMIA resulted in 50,221 gene clusters containing 604,752 genes. The presence of alternative nitrogenases relatedgenes was detected among representatives belonging to M. monacense, P. fungorum and V. guangxiens, as well as in the putative new species G11 and G9. The presence of nifH homologs was as exclusive to 55 strains belonging to Rhizobium. The detection of overlap with extrachromosomal sequences was found only among representatives from Rhizobium and P. fungorum. Multiple transposase genes were located upstream and downstream of the detected nifHDKENX and nifHDKE operons, indicating HGT events. A wide phylogenetic distribution was found at the family level and an outstanding number (≥40) of putative transferred genes were found especially among 12 strains, including putative transfer events from other Domains such as the botanical family Euphorbiaceae, Aspergillaceae, and Siphoviridae. Putative biosynthetic gene clusters were identified. Reclassification of over 25 bacterial species was also proposed based on the comparisons between the type-strain genomes.