Detecção de Tobacco streak virus em Nicotiana tabacum e tripes vetores por meio de RT-PCR em tempo real e respostas quimiotáxicas de Orius insidiosus ao complexo N. tabacum, Myzus persicae e fitormônios

Abstract

A cultura do tabaco, Nicotiana tabacum L. (Solanaceae), tem grande importância para a região Sul do Brasil, pelo elevado valor comercial do produto e pela capacidade de geração de empregos, desde o cultivo até a industrialização. O Tobacco streak virus (TSV), gênero Ilarvirus, agente causal da necrose branca do fumo tem sido registrado no Paraná provocando perdas de produtividade e qualidade nas lavouras de fumo. Os métodos convencionais de detecção apresentam falhas na identificação do TSV por terem baixa sensibilidade e especificidade. Além disso, os modelos de RT-PCR convencionais requerem a purificação do ácido nucleico, o que é laborioso e aumenta o risco de contaminação. Orius insidiosus (Say) (Hemiptera, Anthocoridae) é um predador mundialmente usado como agente de controle biológico de tripes e pulgões, vetores responsáveis pela ocorrência de diversas viroses do fumo. Assim, este trabalho teve como objetivos: a) desenvolver e validar um protocolo de preparação de amostras direto e de RT-PCR em tempo real com uso de sonda TaqMan para detecção do TSV em plantas de tabaco e tripes e b) avaliar as respostas quimiotáxicas de fêmeas de O. insidiosus frente a N. tabacum infestada ou não com Myzus persicae (Sulzer) (Hemiptera, Aphididae); ao pulgão e a plantas de tabaco aspergidas com ácido salicílico e metil jasmonato. Foi comparado o protocolo de purificação de RNA baseado em kit comercial (Promega), com o método de diluição do extrato vegetal para uso direto na RT-PCR em tempo real, com a sonda TaqMan desenvolvida. A RT-PCR em tempo real amplificou tanto a partir de amostras de RNA purificado como de extrato vegetal diluído, e através das diluições se mostrou mais sensível que a RT-PCR em tempo real com o uso de SYBR-Green e ELISA. O protocolo de preparação de amostras e de amplificação por RT-PCR em tempo real com sonda TaqMan, permitiu a detecção do TSV em material vegetal e em tripes, de maneira sensível, específica e precisa. Em relação às respostas quimiotáxicas, fêmeas de O. insidiosus foram atraídas apenas às plantas infestadas com pulgões (p < 0,001). Nenhuma das doses de fitormônios gerou resposta das fêmeas, pois podem não ter alterado o perfil químico das plantas.

Tobacco crop, Nicotiana tabacum L. (Solanaceae) has a great importance in the Southern Brazil, due to the high commercial value of the product and the capacity to employment generation from farming to industrialization. Tobacco streak virus (TSV), genera Ilarvirus, is the causal agent of the streak in tobacco plants and it has been recorded in Paraná causing losses of productivity and quality in tobacco crops. The conventional methods may present flaws in the identification of TSV because they have low sensitivity and specificity. Besides, conventional PCR templates require purification of the nucleic acid, which is laborious and time consuming and increases the risk of contamination. Orius insidiosus (Say) (Hemiptera, Anthocoridae) is worldwide predator used as a biological control agent for thrips and aphids, which are vectors responsible for the occurrence of several tobacco viruses. Thus, this work aimed: a) to develop and validate a protocol for direct sample preparation and real-time RT-PCR amplification, with TaqMan probe, to detect TSV in tobacco plants and thrips; and b) to evaluate chemotactic responses of O. insidiosus females against N. tabacum infested or not by Myzus persicae (Sulzer) (Hemiptera, Aphididae), to aphids and tobacco plants sprayed with salicylic acid and methyl jasmonate. The protocol using purified RNA targets by commercial kit (Promega) was compared with crude plant extracts for direct real time RT-PCR. The real time RT-PCR designed, amplified both purified RNA and crude plant extracts. Using serial dilutions of plant extracts, TaqMan real-time RT-PCR was the most sensitive when compared with SYBR-Green and ELISA techniques. The protocol developed here allows the detection of TSV in crude vegetal extract and in thrips in a sensitive, specific and accurate way. Concerning the chemotactic responses, females of O. insidiosus were attracted only to infested plants with aphids (p < 0,001). None of the phytohormones doses induced response of females, because they may not have altered the chemical profile of the plants.