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dc.contributor.advisorBertolini, Marcelopt_BR
dc.contributor.authorPeña Bello, Camilo Andréspt_BR
dc.date.accessioned2022-09-03T05:00:34Zpt_BR
dc.date.issued2019pt_BR
dc.identifier.urihttp://hdl.handle.net/10183/248492pt_BR
dc.description.abstractO vírus da Diarreia Viral Bovina (BVDV) é um dos principais patógenos virais que causam importantes doenças clínicas em bovinos. A presença deste vírus em rebanhos representa um grande risco para a produtividade por perdas econômicas significativas. O uso da tecnologia de edição gênica, como o sistema CRISPR/Cas9, em animais de produção pode contribuir para o desenvolvimento de modelos de resistência a doenças, como a BVD. Mesmo que os mecanismos de infecção, entrada e liberação do BVDV não sejam totalmente compreendidos, a molécula CD46 é considerada o principal receptor celular para o BVDV em bovinos. O mapeamento do local de adesão ao BVDV demonstrou que dois peptídeos, localizados no módulo mais distal da proteína 1 de controle do complemento (CCP1), fornecem a plataforma de adesão ao BVDV. Os objetivos deste estudo foram (i) caracterizar o CD46 em linhagens celulares bovinas; (ii) modificar a plataforma de adesão do receptor por edição gênica; e (iii) investigar a permissibilidade do BVDV à infecção celular em células editadas geneticamente para o gene CD46. Para caracterizar o receptor, foi sequenciado o DNA complementar do gene CD46 em amostras de fibroblastos bovinos e em linhagens celulares de rim bovino Madin-Darby suscetíveis (MDBK) ou resistentes (CRIB) ao BVDV. Posteriormente, por edição gênica pelo sistema CRISPR/Cas9, criaram-se indels no éxon 1 do gene CD46, removendo oligopeptídeos que conformam a plataforma de adesão do receptor CD46 ao BVDV. Para realizar a edição genômica, duas sequências de RNA-guia (gRNA) foram selecionadas para a deleção do éxon 1 do CD46 em células MDBK. Posteriormente, dois plasmídeos px458, específicos para cada umas das gRNAs, e com expressão da proteína fluorescente verde (GFP), foram co-transfectados em células MDBK. O isolamento de populações de células clonais com modificações específicas das células transfectadas foi realizado por citometria de fluxo, seguido de um período de expansão para estabelecer sub-populações de células clonais. O DNA genômico foi isolado e amplificado por PCR. O produto do PCR foi ligado em plasmídeos pCR-TOPO, transformado em células TOP10 E. coli e sequenciado. Como resultados, identificou-se que as células CRIB codificam uma proteína CD46 semelhante às MDBK e aos fibroblastos, sem nenhuma mutação na região de interesse, com o receptor CD46 não apresentando aparente importância na resistência destas células à infecção por BVDV. Além disso, obtivemos três linhagens celulares MDBK com deleção em segmentos específicos na região codificante para o CCP1 referente a plataforma de adesão ao BVDV. Uma das linhagens apresentou a deleção bialélica, com a edição gênica sendo diferente em cada alelo; outra linhagem apresentou uma edição bialélica, com um dos alelos não apresentando a deleção da plataforma de adesão; e a última linhagem apresentou uma deleção bialélica homozigota. O estudo da susceptibilidade destas células mutantes à infecção pelo BVDV encontra-se em andamento. Com as três linhagens celulares bovinas modificadas geneticamente para a plataforma de adesão do receptor CD46 ao BVDV, tem-se a expectativa que estas modificações genéticas possivelmente levarão a uma diminuição na infecção pelo BVDV, o que permitirá obtermos mais informações sobre o mecanismo de entrada e infecção do vírus em células bovinas. Tal estratégia mostra-se viável para a futura geração de bovinos resistentes ao BVDV por biotécnicas avançadas da reprodução, como pela clonagem por transferência nuclear de células somáticas (TNCS).pt_BR
dc.description.abstractThe Bovine Viral Diarrhea virus (BVDV) is one of the major viral pathogens that cause important clinical diseases in cattle. The presence of the virus in herds represents a major risk for productivity due to significant economic losses. The use of gene-editing technology, such as the CRISPR/Cas9 system, in livestock animals can contribute to the development of disease resistance models, such as BVD. Even though the mechanisms of infection, entry and release of BVDV are not yet fully understood, the CD46 molecule is considered the major cellular receptor for BVDV in cattle. The mapping of the adhesion site to the BVDV revealed that two peptides, located in the most distal domain of the complement control protein 1 (CCP1), provide the adhesion platform for the virus. The aims of this study were (i) to characterize CD46 in bovine cell lines; (ii) to modify the platform of adhesion of the CD46 receptor by gene edition; and (iii) to investigate the permissibility of BVDV to cellular infection in CD46 gene-edited cells. To characterize the receptor, the complementary DNAof the gene CD46 was sequenced on samples of fibroblast cells and in Madin-Darby bovine kidney cell lines (MDBK) or MDBK susceptible cells and on cells resistant to BVDV infection (CRIB cells). Afterwards, by gene editing using the CRISPR/Cas9 system, indels were created in the exon 1 of the CD46 gene, removing oligopeptides that form the CD46 receptor adhesion platform to BVDV. To achieve the genomic edition, two sequences of guiding RNA (gRNAs) were selected for exon 1 deletion of CD46 in MDBK cells. Subsequently, two px458 plasmids, each encoding one of the gRNAs, and expressing the green fluorescent protein (GFP), were co-transfected into MDBK cells. Isolation of clonal cell populations with specific modifications of the transfected cells was done through Fluorescence Activated Cell Sorting, followed by an expansion period to establish new clonal cell lines. Genomic DNA was isolated and amplified by PCR. The PCR amplified products were ligated into pCR-TOPO plasmid and transformed into TOP10 E. coli cells, and DNA-sequenced. Our results indicated that CRIB cells express a CD46 protein similar to MDBK and fibroblast cells, without any mutation in the region of interest, with the CD46 receptor in CRIB cells showing an apparent no importance in the resistance to BVDV infection. Furthermore, we obtained three MDBK cell lines with deletion in specific segments in the coding region for CCP1 referring to the BVDV adhesion platform. One of the lines presented a biallelic deletion of the adhesion platform, with gene edition being different in each allele; another line presented a biallelic edition, with one of the alleles not containing the adhesion platform deletion; and the last line presented a biallelic homozygous deletion. However, the study of the susceptibility of such mutant cells to BVDV infection is still ongoing. With the three genetically modified bovine cell lines to the CD46 receptor adhesion platform on BVDV, such genetic modification will possibly lead to a decrease in BVDV infection, which may allow us to obtain more pieces of information regarding mechanisms of virus entry and infection in bovine cells. Such a strategy proves to be feasible for the future generation of BVDV resistant animals by the use of advanced reproductive technologies, such as cloning by somatic cell nuclear transfer (SCNT).en
dc.format.mimetypeapplication/pdfpt_BR
dc.language.isoporpt_BR
dc.rightsOpen Accessen
dc.subjectBovine viral diarrhea virusen
dc.subjectVírus da diarréia viral bovinapt_BR
dc.subjectPatogenicidadept_BR
dc.subjectCD46 receptoren
dc.subjectEdição de genespt_BR
dc.subjectGenome editingen
dc.subjectProteína cofatora de membranapt_BR
dc.subjectCRISPR/ Cas9en
dc.titleThe role of the CD46 receptor in the pathogenicity of the bovine viral diarrhea virus infection in bovine cultured cellspt_BR
dc.typeDissertaçãopt_BR
dc.identifier.nrb001090668pt_BR
dc.degree.grantorUniversidade Federal do Rio Grande do Sulpt_BR
dc.degree.departmentFaculdade de Veterináriapt_BR
dc.degree.programPrograma de Pós-Graduação em Ciências Veterináriaspt_BR
dc.degree.localPorto Alegre, BR-RSpt_BR
dc.degree.date2019pt_BR
dc.degree.levelmestradopt_BR


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