Proteases Pr1 de Metarhizium anisopliae : evolução, estrutura e função

Abstract

A família Pr1 de proteases tem papel importante na patogenicidade e virulência de artropatógenos como Metarhizium anisopliae. Esses fatores de virulência geralmente atuam na penetração da cutícula do hospedeiro, etapa essencial do processo infectivo. Há 11 proteoformas de Pr1 (Pr1A a Pr1K) descritas. Essa família é dividida em duas classes, sendo que a Classe II (tipo-proteinase K) inclui 10 parálogos subdivididos em três subfamílias. Essas proteoformas agem em sinergia e com outros fatores de virulência, conferindo patogenicidade a diferentes hospedeiros. À medida em que a virulência coevolui por seleção recíproca com os hospedeiros, a seleção positiva pode levar à evolução de novas famílias de proteases ou parálogos das existentes que possam superar as defesas do hospedeiro. Essa hipótese é suportada por proteínas Pr1 da Classe II, pois evidenciamos: (i) seleção positiva em seis dos dez parálogos de Pr1 (em maioria no domínio proteolítico); (ii) divergência funcional Tipo I em comparações intra-subfamília, com suporte a uma potencial nova proteoforma de Pr1J; (iii) localizações projetadas em estrutura terciária próximas ao sítio catalítico, com potencial impacto na catálise. Uma abordagem mista computacional-experimental foi desenvolvida para caracterizar essa nova proteoforma de Pr1J e identificar os efeitos de sua evolução, utilizando simulações comparativas por dinâmica molecular e expressão heteróloga em Escherichia coli. Até o momento, diferentes elementos estruturais e comportamentos conformacionais podem ser observados entre ambas as proteoformas de Pr1J. Ademais, as construções de vetores plasmidiais foram bem-sucedidas, embora a sua expressão não tenha sido possível. Em conjunto, essa abordagem mista pode apontar os efeitos da duplicação e diversificação proteica nas capacidades proteolíticas de M. anisopliae. Até o momento, os resultados implicam a existência de pressão seletiva diferencial em genes pr1 e uma potencial nova proteoforma, provavelmente afetando especificidade de hospedeiros, virulência ou ainda adaptando o organismo a diferentes estilos de vida independentes do hospedeiro.

The Pr1 family of proteases plays an important role in pathogenicity and virulence of arthropathogens such as Metarhizium anisopliae. These virulence factors are active during the penetration of the host cuticle, an essential step in the infective process of this fungus, which possesses 11 Pr1 proteoforms (Pr1A through Pr1K). This family is divided in two classes, with Class II (proteinase K-like) comprising 10 paralogs further split into three subfamilies. These proteoforms act synergistically and with other virulence factors, conferring pathogenicity to multiple hosts. As virulence coevolves by reciprocal selection with hosts, positive selection may lead to the evolution of new protease families or paralogs of extant ones that can withstand host defenses. This hypothesis is supported in Class II Pr1 proteins, as we have evidenced: (i) positive selection in six out of ten Pr1 paralogs (mostly located on the proteolytic domain); (ii) Type I functional divergence in intra-subfamily pairwise comparisons, also supporting a potential novel Pr1J proteoform; (iii) tertiary structure projected locations being closely located to the enzyme’s catalytic cleft, potentially impacting catalysis. A mixed computational-experimental approach was developed in order to characterize this novel Pr1J protein proteoform and identify the effects of positively selected sites and residues related to functional divergence, by means of comparative molecular dynamics simulations and heterologous expression in bacterial vectors. While these analyses are currently underway, different structural elements and conformational behaviors can already be observed among both Pr1J proteoform. Furthermore, plasmidial vector constructions have been successful, although their expression is yet to be accomplished. In conjunction, this mixed approach should provide a comprehensive view of the effects of protein duplication and diversification regarding proteolytic capabilities in M. anisopliae. So far, our results imply the existence of differential selective pressure acting on pr1 genes and a potential novel proteoform, likely affecting host specificities, virulence or even adapting the organism to different host-independent lifestyles.