Biotecnologias para avaliação da viabilidade e criopreservação de gametas do coral endêmico Mussismilia harttii (VERRILL, 1868)

Abstract

Os recifes de coral constituem um dos ecossistemas mais diversos do planeta, exercendo um papel fundamental na manutenção dos recursos pesqueiros que mantem diversas comunidades humanas em todo o mundo. No entanto, os fatores antrópicos e mudanças ambientais vem ocasionando severos danos a este ecossistema. Dessa forma, o desenvolvimento de técnicas que visem sua conservação é fundamental, entre elas, o uso da criopreservação seria uma ferramenta alternativa para a manutenção de novos corais. O objetivo desse trabalho foi desenvolver biotecnologias para avaliar a viabilidade dos gametas do coral endêmico M. harttii, e desenvolver um protocolo de criopreservação para armazenamento do gameta masculino por tempo indeterminado, criando assim o primeiro banco de gametas de coral do Atlântico Sul. Para a avaliação da viabilidade oocitária, foi utilizado o teste de brometo de azul de tiazolil tetrazólio (MTT) e o teste de azul de tripano (TB). Os testes de TB foram realizados em duas condições. Inicialmente os oócitos foram expostos a 1, 3, 5, 7 e 9 mol-1 de dimetilsulfóxido (DMSO) por 20 min, depois incubados em 0,4% de TB e tiveram sua integridade de membrana avaliada. Posteriormente, os oócitos mortos foram incubados em TB diluído em água do mar filtrada ou dodecil sulfato de sódio (SDS). Para experimentos de MTT, um ensaio de diluição em série foi realizado usando DMSO como composto citotóxico. O TB conseguiu atravessar a membrana do oócito, mas devido ao seu alto teor de lipídios, a observação da coloração azul não foi possível, inviabilizando este teste para oócitos de M. harttii. Conseguimos padronizar o ensaio MTT para determinar a atividade mitocondrial em oócitos maduros do coral, e consequentemente avaliar sua viabilidade. Através do ensaio MTT descobrimos a diluição de DMSO que nos permitiu definir uma concentração segura (1,4 M) para trabalhar com oócitos de coral. O protocolo para a criopreservação das células espermáticas foi desenvolvido o melhor crioprotetor, concentração e técnica de criopreservação. Os espermatozoides foram expostos ao crioprotetor dimetilsulfóxido e metanol em concentrações de 10, 15 e 20%. Os espermatozoides foram criopreservados com sucesso em DMSO 20% usando congelamento lento. De modo geral, como resultados desse trabalho alcançamos um método confiável para avaliação da viabilidade de oócitos e um protocolo eficiente para congelamento do sêmen de M. harttii. Essas ferramentas biotecnológicas poderão ajudar na preservação da diversidade genética, e assegurar a existência dos recifes de coral.

Coral reefs are one of the most diverse ecosystems on the planet, playing a fundamental role in maintaining fishing resources that support diverse human communities around the world. However, anthropic factors and environmental changes have caused severe damage to this ecosystem. Thus, the development of techniques aimed at their conservation is fundamental, among them, the use of cryopreservation would be an alternative tool for the maintenance of new corals. The objective of this work was to develop biotechnologies to evaluate the viability of gametes from the endemic coral M. harttii, and to develop a cryopreservation protocol for indefinitely storing the male gamete, thus creating the first coral gamete bank in the South Atlantic. To assess oocyte viability, the thiazolyl blue tetrazolium bromide (MTT) test and the trypan blue (TB) test were used. TB tests were performed under two conditions. Initially the oocytes were exposed to 1, 3, 5, 7 and 9 mol-1 of dimethylsulfoxide (DMSO) for 20 min, then incubated in 0.4% TB and their membrane integrity was evaluated. Subsequently, the dead oocytes were incubated in TB diluted in filtered seawater or sodium dodecyl sulfate (SDS). For MTT experiments, a serial dilution assay was performed using DMSO as the cytotoxic compound. TB was able to cross the oocyte membrane, but due to its high lipid content, the observation of blue staining was not possible, making this test unfeasible for M. harttii oocytes. We were able to standardize the MTT assay to determine mitochondrial activity in mature coral oocytes, and consequently assess their viability. Through the MTT assay we discovered the DMSO dilution that allowed us to define a safe concentration (1.4 M) to work with coral oocytes. The protocol for cryopreservation of sperm cells was developed using the best cryoprotectant, concentration and cryopreservation technique. Spermatozoa were exposed to DMSO and methanol at concentrations of 10, 15 and 20%. Sperm was successfully cryopreserved in 20% DMSO using slow freezing. In general, as a result of this work, we achieved a reliable method for evaluating oocyte viability and an efficient protocol for freezing M. harttii sperm. These biotechnological tools could help preserving genetic diversity, and ensure the existence of coral reefs.