Proteínas recombinantes : produção da enzima transcritase reversa do vírus murino da leucemia de moloney (M-MLV-RT) e avaliação do efeito antimicrobiano da subunidade beta da urease de proteus mirabilis

Abstract

Proteínas recombinantes são de suma importância no contexto médico, na indústria e na pesquisa. Neste trabalho, duas proteínas recombinantes de interesse biotecnológico foram produzidas e purificadas: a Transcritase Reversa do Vírus Murino da Leucemia de Moloney (M-MLV-RT) e a subunidade Beta da Urease de Proteus mirabilis (PmUreβ). A M-MLV-RT é a transcritase reversa de maior uso comercial, com aplicações tanto para a pesquisa quanto para o diagnóstico clínico. Em 2020, com a pandemia de COVID-19, houve aumentos de preços e falta de M-MLV-RT no país, afetando a pesquisa de diferentes áreas que fazem uso desse insumo, bem como o diagnóstico de SARS-CoV-2. Assim, foi desenvolvido um protocolo inicial para a produção da enzima pelo Centro de Biotecnologia da UFRGS. Neste trabalho, objetivamos a otimização da produção desta enzima, a fim de tornar a produção mais estável no futuro, e o teste de sua atividade enzimática. A transformação foi identificada como maior gargalo da produção da enzima e os parâmetros testados, assim como o uso de diferentes linhagens para a expressão (E. coli BL21(DE3) pTGroE e E. coli Lemo21), não foram suficientes para melhorar a eficiência da transformação. Já a atividade enzimática foi satisfatória em comparação com enzimas comerciais fornecidas pelas empresas Qiagen, Sigma e iScript, especialmente com o tempo de incubação de 30 minutos, inclusive após 6 meses de estoque da enzima a -20 °C. A PmUreβ, segunda proteína produzida neste trabalho, é uma subunidade da urease de P. mirabilis. A PMU é um fator de virulência capaz de realizar a hidrólise da ureia, aumentando o pH do meio e proporcionando a sobrevivência e colonização de P. mirabilis no trato urinário humano. Esta enzima apresenta toxicidade contra insetos e leveduras e tal atividade não está relacionada à propriedade catalítica, observada também quando se testa isoladamente apenas a sua subunidade beta, PmUreβ. Neste trabalho, avaliamos a atividade antibacteriana desta proteína contra Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus em meio contendo diferentes concentrações de PmUreβ (0,56, 1,125, 2,25 e 4,5 µM). Não observamos inibição do crescimento das colônias de P. aeruginosa para as concentrações testadas, mas se obteve redução da multiplicação bacteriana de S. aureus para a concentração de 1,125 µM (P<0,05). Mais estudos serão necessários para melhor caracterizar o potencial antibacteriano de PmUreβ.