Ensaios in silico com a enzima Niemann-Pick C1-Like 1 de duas espécies de cestódeos

Abstract

Cestódeos são parasitas causadores de doenças infecciosas em humanos e animais, que causam prejuízo de bilhões de dólares ao ano no mundo, na sáude humana, saúde veterinária e na pecuária. Atualmente, as principais formas de tratamento de infecções humanas por formas larvais desses parasitos são baseadas no uso de fármacos da classe dos benzimidazóis, muitas vezes pouco eficiente, e por intervenções cirúrgicas. Isso faz com que haja demanda crescente de novas formas de tratamento e de novos fármacos. Uma importante estratégia, que pode ser usada, e envolve menos investimento do que o desenvolvimento de um fármaco com uma nova fórmula, é o reposicionamento de fármacos já regulamentados por órgãos de saúde no mundo, e já usados em humanos ou animais. Nesse contexto, temos a ezetimiba, um fármaco já regulamentado e usado em humanos para o controle de dislipidemias, e que poderia ser possivelmente empregado no tramento de infecções por cestódeos, uma vez que esses organismos são dependentes da absorção do colesterol proveniente do hospedeiro para sua sobrevivência. Esses organismos possuem enzima ortólogas à enzima humana Niemann-pick C1-Like 1 (NPC1L1, alvo do fármaco ezetimiba), que também estão envolvidas no transporte de colesterol para dentro das células. A partir disso, foi feita uma série de análises in silico preliminares, para avaliar o grau de conservação entre as proteínas de cestódeos e a humana, o que indicaria incialmente a possibilidade da alternativa de reposicionamento do fármaco inibidor. A sequência da NPC1L1 humana foi recuperada do banco de dados UniProt e usada como sonda para busca in silico de ortólogas de helmintos parasitas no banco de dados WormBase Parasite. A partir disso, foram identificadas 4 enzimas ortólogas da NPC1L1 humana nas duas espécies de cestódeos disponíveis para análises in vitro, Mesocestoides corti, modelo para estudo em cestódeos, e Echinococcus granulosus. Também foram identificados os genes e os transcritos correspondentes. Foi observado que o número de éxons, o tamanho dos transcritos e o tamanho das proteínas em resíduos de aminoácidos se assemelha bastante entre humanos e as duas espécies analisadas. Além disso, todas as proteínas apresentavam os domínios de interesse para análise (domínios N-terminal e domínio sensível a colesterol), além de outros domínios semelhantes a proteína humana, anotados em bancos de dados de famílias de proteínas. Após, usando as sequências das proteínas dos parasitos e a humana, foi feito um alinhamento múltiplo no software MAFFT7 e buscou-se o trecho, que de acordo com a literatura, seria o de interação entre o fármaco e a enzima humana. A porção mostrou boa identidade entre as três e um bom score do alinhamento (matriz BLOSUM62). Ainda foram recuperadas do WormBase Parasite sequências das proteínas de cestódeos potencialmente ortólogas, que apresentassem semelhanças em número de aminoácidos e em domínios preditos com as das duas espécies já analisadas e a humana. Usando-se essas sequências, e as sequências de Mus musculus e Drosophila melanogaster (grupo externo), foi construída uma árvore filogenética. A árvore mostrou a conservação esperada, com a separação correta dos grupos, com exceção dos gêneros Echinococcus e Hymenolepis, que foram agrupados de forma irregular (principalmente as duas proteínas parálogas de E. granulosus), o que poderia ser devido a problemas na anotação das sequências no banco de dados de onde foram recuperadas, pois essas sequências ainda não foram revisadas manualmente. Todos resultados das análises realizadas indicaram incialmente a conservação da enzima dos parasitos e que seria viável a realização de mais estudos de reposicionamento de fármaco, fazendo análises mais aprofundadas in silico e in vitro.

Cestodes are parasites that cause infectious diseases in humans and animals, which causes the loss of bil lions of dollars a year in the world, in human health, veterinary health and livestock. Currently, the most used forms of treatment for infection in humans by the larval form of these parasites, is based on the use of drugs from benzim idazole class and surgical intervention, which is often inefficient. This causes the increase of demand for new forms of treatment and new drugs. An important strategy, which can be used, and requires less investment than the devel opment of drugs with a new formula, is the repositioning of drugs that are already regulated by health agencies around the world, and are already used in humans or animals. In this context, we have ezetimibe, a drug that is already regulated and used in humans to control dyslipidemia, and which could possibly be used in the treatment of cestode infections, since these organisms are dependent on the absorption of cholesterol from the host for their survival. These organisms have the enzyme orthologs to the human enzyme Niemann-pick C1-Like 1 (NPC1L1, target of ezetimibe), which are also involved in the transport of cholesterol into the cells. From this, a series of preliminary in silico analyzes were carried out, to evaluate the degree of conservation between the proteins of cestodes and the human, which would initially indicate a possibility of the alternative of repositioning the inhibitor drug. The human NPC1L1 sequence was retrieved from the UniProt database and used as a probe for in silico search for helminth parasite orthologs in the WormBase Parasite database. From this, four orthologous enzymes of human NPC1L1 were identified in two species of cestodes available for in vitro analysis, Mesocestoides corti, a model organism for study in cestodes, and Echinococcus granulosus. The corresponding genes and transcripts were also identified. It was ob served that the number of exons, the size of transcripts and the size of proteins in amino acid residues are very similar between humans and the two species analyzed. In addition, all proteins had the domains of interest for analysis (N terminal domain and cholesterol-sensitive domain), and other similar domains to those of human protein, annotated in protein family databases. Afterwards, using the sequences of the proteins of the parasites and the human, a multiple alignment was made in the MAFFT7 software, and the patch, which according to the literature, would be the inter action between the drug and the human enzyme, was searched. The patch showed good identity between the three and a good alignment score (BLOSUM62 matrix). Sequences of potentially orthologous cestode proteins that pre sented similarities in number of amino acids and in predicted domains, with those of the two species already analyzed and the human, were also recovered from WormBase Parasite. Using these sequences, plus the sequences of Mus musculus and Drosophila melanogaster (outside group), a phylogenetic tree was constructed. The tree showed the expected conservation, with the correct separation of groups, with the exception of the genera Echinococcus and Hymenolepis, which were irregularly grouped (mainly the two paralogous proteins of E. granulosus), which could be due to problems in annotation of the sequences in the database from which they were retrieved, as these sequences have not yet been manually reviewed. All results of the analyzes carried out initially indicated the conservation of the enzyme in the parasites and that it would be feasible to carry out more drug repositioning studies, making more in-depth analyzes in silico and in vitro.