Desenvolvimento de um modelo experimental de doença hepática alcoólica em ratos Wistar : da lesão hepática à disbiose intestinal

Abstract

Introdução: A doença hepática alcoólica (DHA) embora seja a principal causa hepática de internação e óbito, ainda recebe pouca atenção. Ademais, exceto a abstenção alcoólica, não há tratamento farmacológico estabelecido. A disbiose intestinal está associada à DHA, e é um alvo terapêutico a ser explorado. Modelos experimentais são úteis para testar novas alternativas, mas os modelos de DHA são difíceis de reproduzir e onerosos. Objetivos: Desenvolver modelo experimental de DHA que seja reprodutível e de baixo custo, avaliar a indução de disbiose intestinal, através da análise da composição e diversidade da microbiota entérica, e estimar sua relação com a lesão hepática. Métodos: Foram randomizados 24 ratos Wistar machos em três grupos experimentais: controle (CONT; n=8), alimentados com ração padrão e água com 0,05% de sacarina sódica ad libitum por 4 semanas; álcool 4 (ALC4; n=8), que receberam semente de girassol e etanol a 10% com 0,05% de sacarina sódica ad libitum por 4 semanas; e álcool 8 (ALC8; n=8) que receberam semente de girassol e etanol a 10% com 0,05% de sacarina sódica ad libitum por 8 semanas. Os animais dos grupos ALC4 e ALC8 receberam, por gavagem, 9 horas antes da eutanásia, sobrecarga alcoólica (5g/kg); os animais do grupo CONT receberam água estéril pela mesma via. Foram coletados dados de ingestão alimentar, peso e altura dos animais para avaliação de consumo alimentar e cálculo do índice de Lee; soro e fígado para avaliação bioquímica e de marcadores inflamatórios; e fezes para análise da microbiota intestinal. Todos os procedimentos foram aprovados pela Comissão de Ética para Uso de Animais do HCPA (n° 2018-0257). Resultados: Todos os animais completaram o período de experimentação antes da sobrecarga alcoólica. O consumo total de calorias, líquidos, alimentos sólidos, carboidratos e proteínas foi menor nos grupos ALC4 e ALC8 que nos animais CONT (p<0,01 para todos). O índice de Lee foi menor no grupo ALC 8 em relação a ALC 4 (p<0,01) e CONT (p<0,01), enquanto o consumo de etanol e lipídios foi superior nos grupos ALC4 e ALC8 (p<0,01 para ambos) em relação ao CONT. Os animais do grupo ALC4 apresentaram níveis mais elevados de aspartato aminotransferase (AST), alanina aminotransferase (ALT), fosfatase alcalina (FA) e colesterol total (CT) e mais baixos de albumina que os animais CONT (p<0,03 para todos). No grupo ALC8, glicemia, AST, ALT e FA foram mais elevados que nos CONT (p<0,03 para todos), ao mesmo tempo em que houve redução de CT, HDL colesterol e albumina (p<0,03 para todos). A deposição hepática de triglicerídeos (TG), CT e gorduras totais variou de forma decrescente entre os grupos ALC8, ALC4 e CONT (p<0,05). Animais dos grupos ALC4 e ALC8 apresentaram esteatose (microvesicular grau 2 e macrovesicular grau 1; e microvesicular grau 3 e macrovesicular grau 1, respectivamente), enquanto os animais do grupo CONT não tiveram alteração na histologia hepática; em nenhum grupo houve deposição de fibras de colágeno. Os marcadores inflamatórios hepáticos IL-1β, IL-6 e IL-10 não apresentaram diferenças entre os grupos. Houve redução da diversidade bacteriana fecal, com menor abundância relativa do gênero Firmicutes (p<0,005) e maior de Bacteroidetes (p<0,0007) e Proteobacteria (p<0,001) nos grupos ALC4 e ALC8. Foi observado a correlação entre a comunidade microbiana e marcadores da DHA como esteatose, acúmulo de gordura, TG e CT hepáticos e ALT, AST, FA e albumina séricos. Conclusão: O modelo desenvolvido foi capaz de induzir anormalidades bioquímicas e histológicas hepáticas, assim como disbiose intestinal, que reproduzem as alterações descritas na DHA em humanos.

Introduction: Alcoholic liver disease (ALD), although the main hepatic cause of hospitalization and death, still receives little attention. Furthermore, except for alcohol abstention, there is no established pharmacological treatment. Intestinal dysbiosis is associated with DHA and is a therapeutic target to be explored. Experimental models are useful for testing new alternatives, but DHA models are both safe and expensive. Objectives: To develop an experimental model of DHA that is reproducible and inexpensive, to evaluate the induction of intestinal dysbiosis, through the analysis of the composition and diversity of the enteric microbiota, and to estimate its relationship with liver damage. Methods: Twenty-four male Wistar rats were randomized into three experimental groups: control (CONT; n=8), fed standard chow and water with 0.05% sodium saccharin ad libitum for 4 weeks; alcohol 4 (ALC4; n=8), which received sunflower seed and 10% ethanol with 0.05% sodium saccharin ad libitum for 4 weeks; and alcohol 8 (ALC8; n=8) that received sunflower seed and 10% ethanol with 0.05% sodium saccharin ad libitum for 8 weeks. The animals in the ALC4 and ALC8 groups received, by gavage, 9 hours before euthanasia, alcoholic overload (5g/kg); the animals in the CONT group received sterile water by the same route. Data on food intake, weight and height of the animals were collected to assess food consumption and calculate the Lee index; serum and liver for biochemical and inflammatory markers evaluation; and feces for analysis of the intestinal microbiota. All procedures were approved by the HCPA Ethics Committee for the Use of Animals (n° 2018-0257). Results: All animals completed the experimentation period before alcohol overload. The total consumption of calories, liquids, solid foods, carbohydrates, and proteins was lower in the ALC4 and ALC8 groups than in the CONT animals (p<0.01 for all). The Lee index was lower in the ALC 8 group compared to ALC 4 (p<0.01) and CONT (p<0.01), while the consumption of ethanol and lipids was higher in the ALC4 and ALC8 groups (p<0 .01 for both) in relation to CONT. The animals in the ALC4 group had higher levels of aspartate aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT), alkaline phosphatase (AP) and total cholesterol (TC) and lower levels of albumin than CONT animals (p <0.03 for all). In the ALC8 group, blood glucose, AST, ALT and FA were higher than in the CONT (p<0.03 for all), while there was a reduction in TC, HDL cholesterol and albumin (p<0.03 for all). Hepatic deposition of triglycerides, TC and total fat varied in a decreasing way between the ALC8, ALC4 and CONT groups (p<0.05). Animals in the ALC4 and ALC8 groups presented steatosis (microvesicular grade 2 and macrovesicular grade 1; and microvesicular grade 3 and macrovesicular grade 1, respectively), while the animals in the CONT group had no change in liver histology; in no group there was deposition of collagen fibers. The hepatic inflammatory markers IL-1β, IL-6 and IL-10 showed no differences between the groups. There was a reduction in fecal bacterial diversity, with a lower relative abundance of the genus Firmicutes (p<0.005) and a higher abundance of Bacteroidetes (p<0.0007) and Proteobacteria (p<0.001) in the ALC4 and ALC8 groups. A correlation was observed between the microbial community and DHA markers such as steatosis, fat accumulation, hepatic TG and CT and serum ALT, AST, AP and albumin. Conclusion: The model developed was able to induce hepatic biochemical and histological abnormalities, as well as intestinal dysbiosis, which reproduce the changes described in DHA in humans.