Produção em escala piloto da proteína recombinante Jaburetox e desenvolvimento de curativos bioativos a partir de matrizes de Poli(ácido lático) e Jaburetox.

Abstract

O uso de polímeros em aplicações biomédicas, principalmente na preparação de curativos, tem aumentado nos últimos anos e despertado interesse biotecnológico. Dentre os diversos polímeros existentes, o poli(ácido lático) (PLA) tem apresentado um crescimento significativo em sua utilização na área médica por ser biodegradável, seguro e biocompatível. Um curativo constituído de PLA, além de apresentar tais características, pode ainda ser bioativo, caso seja incorporado a ele alguma biomolécula com propriedades biológicas, como é o caso da proteína recombinante Jaburetox. Este peptídeo recombinante vem sendo estudado por nosso grupo devido às suas atividades antifúngicas, inseticidas e antibacterianas. Desta forma, pela presente monografia teve-se como objetivos: 1) produzir Jaburetox em escala piloto, em biorreator de 5 L; 2) preparar matrizes de PLA e PLA com cetoconazol pela técnica de eletrofiação, com incorporação de Jaburetox de forma adsorvida ou covalente; 3) avaliar as matrizes quanto às suas propriedades antifúngicas utilizando Candida albicans; e 4) verificar a potencial aplicação como curativos bioativos pela viabilidade de queratinócitos humanos em contato com as matrizes. A produção em escala piloto de Jaburetox em biorreator apresentou um rendimento promissor, sendo até três vezes superior quando comparado com o obtido em escala laboratorial. Esse rendimento ainda pode ser otimizado, com melhor controle de determinados parâmetros do bioprocesso. As matrizes de PLA contendo ou não o fármaco cetoconazol foram produzidas por meio da técnica de eletrofiação com sucesso. Contudo, as que possuíam o fármaco na sua composição apresentaram maior fragilidade em comparação com PLA puro. As matrizes de PLA e PLA/cetoconazol funcionalizadas por adsorção com Jaburetox apresentaram maior atividade antifúngica em relação às matrizes sem tratamento. Já as matrizes funcionalizadas por ligação covalente com o peptídeo apresentaram resultados contrastantes. As matrizes contendo apenas PLA foram ativas igualmente ao tratamento de adsorção, porém as contendo o fármaco não apresentaram atividade antifúngica. Provavelmente, o tratamento covalente das matrizes inativou o cetoconazol, sendo que as mesmas não apresentaram atividade contra a levedura. A viabilidade dos queratinócitos não 6 foi afetada pelas matrizes de PLA. Contudo, as matrizes de PLA/cetoconazol com Jaburetox adsorvido apresentaram leve toxicidade aos queratinócitos. Mais estudos deverão ser conduzidos com outros tipos celulares presentes na derme e epiderme a fim de confirmar a toxidade das matrizes. Os dados obtidos neste trabalho permitiram demonstrar os possíveis potenciais biotecnológicos do biopolímero PLA e de Jaburetox para o desenvolvimento de curativos bioativos.

The use of polymers in biomedical applications has increased in the past years and has aroused biotechnological interest mainly in the preparation of wound dressings. Among several existing polymers, polylactic acid presented a significant increase in medical utilization due to its biodegradability, safety and biocompatibility. PLA wound dressings, besides presenting such features, may still be bioactive if any biomolecule with biological properties is incorporated in its structure such as the recombinant protein Jaburetox. This recombinant peptide has been studied by our group due to its antifungal, insecticide and antibacterial activities. Thus, by this monograph we aimed: 1) to produce Jaburetox at pilot scale in a 5 L bioreactor; 2) to prepare scaffolds of PLA and PLA with ketoconazole, using the electrospinning technique, with the incorporation of Jaburetox in an adsorbed or covalent form; 3) to evaluate antifungal properties of the produced scaffolds using Candida albicans; and 4) to verify the potential application as bioactive dressings by the viability of human keratinocytes in contact with scaffolds. The production at pilot scale of Jaburetox in 5 L-bioreactor showed a promising yield, obtaining up to three times more Jaburetox when compared with laboratory scale. The better control of certain parameters of the bioprocess may optimize the final yield. PLA scaffolds containing or not ketoconazole were successfully produced by the electrospinning technique. However, PLA/ketoconazole scaffolds seem to be fragile in comparison with pure PLA. PLA and PLA/ketoconazole scaffolds functionalized with Jaburetox through adsorption presented greater antifungal activity compared to untreated scaffolds. Nevertheless, the scaffolds functionalized with the peptide through covalent treatment presented contrasting results. Scaffolds containing only PLA were equally active to the adsorption treatment. However, scaffolds containing ketoconazole did not show antifungal activity. Probably, the covalent treatment of scaffolds inactivated the drug and, consequently, the scaffolds were not active against the yeast. Keratinocytes viability was not affected by PLA scaffolds. On the other hand, PLA/ketoconazole scaffolds with adsorbed Jaburetox presented a slight toxicity towards keratinocytes. More studies should be conducted with other cell types 8 found in dermis and epidermis to confirm the toxicity of these scaffolds. The data obtained in this work allowed us to demonstrate the biotechnological potential of PLA biopolymer and Jaburetox to the development of wound dressings.