Extração e caracterização de colágeno de pele de Tilápia (Oreochromis Niloticus) : avaliação do seu potencial na formulação de hidrogéis para medicina regenerativa

Abstract

Neste estudo, colágeno tipo I foi extraído de pele do peixe tilápia (Oreochromis niloticus), com base em sua solubilidade em ácido acético (HAc). Para extração, a pele foi previamente tratada em solução de cloreto de sódio (NaCl) e hidróxido de sódio (NaOH). Foi observado que as peles tratadas em NaOH apresentaram maior solubilidade em HAc e resultaram em uma solução mais viscosa. O colágeno solúvel em HAc foi então purificado por salting-out utilizando NaCl e sulfato de amônio ((NH4)2SO4) à 2 mol L-1 e 0,9 mol L-1. Houve precipitação do colágeno I em ambas as concentrações, no entanto, em concentrações salinas mais elevadas houve precipitação de outras proteínas, o que foi possível ser comprovado pelo perfil de SDS-PAGE das amostras. O colágeno extraído foi caracterizado por análises de DSC e TGA a fim de determinar a temperatura de desnaturação e temperatura máxima de degradação, respectivamente. A caracterização química e estrutural foi determinada por FTIR-ATR e Dicroísmo Circular. Posteriormente, o colágeno extraído foi empregado na formulação de hidrogéis utilizando poli(etileno glicol) (PEG) e quitosana (Q). Para isso, o PEG foi primeiramente funcionalizado com grupos reticuláveis através da reação com anidrido metracrílico. A funcionalização pode ser confirmada pela análise de ressonância magnética nuclear de próton (RMN 1H). Foram preparados hidrogéis contendo PEG/Q e hidrogéis contendo PEG/Q-Col em duas concentrações diferentes de colágeno, 2 mg mL-1 e 6 mg mL-1. Os hidrogéis foram reticulatos utilizando persulfato de potássio (PSP) como iniciador e N,N,N’,N’-tetraetilenodiamina (TEMED) como ativador, em duas quantidades diferentes, 10 mmol e 15 mmol, resultando em 6 diferentes sistemas de hidrogéis. A presença do colágeno pode ser comprovada através dos espectros FTIR-ATR, sendo a sua inserção ao hidrogel resulta em uma redução do grau de intumescimento. Os ensaios biológicos realizados mostraram que os hidrogéis elaborados não apresentaram toxicidade à célula e podem servir como substrato para adesão celular.

In the present work, collagen type I was extracted and isolated from tilapia’s skin (Oreochromis niloticus) using acetic acid. In order to extract said protein, the raw material was previously pre-treated with sodium chloride and sodium hydroxide to evaluate which would further assist the extraction. It could be observed that skins treated with sodium chloride showed greater solubility in acetic acid thus resulting on a higher yield of acid solution. The acid solution was further salted-out with sodium chloride and ammonium sulfate to concentrations of 2 mg mL-1 and 0,9 mg ml-1. It was observed that collagen proteins were isolated on both concentrations salt, whereas higher concentrations also showed proteins other than collagen type I, which can be observed by SDS-PAGE. Calorimetric techniches were used to determine undernature e degradation temperatures. Also, CD and FTIR-ATR were used to further analyse the chemical structure of the protein. The isolated collagen was used to prepare PEG and chitosan hydrogel. In order to prepare these hydrogels, PEG was functionalized with methacrylate groups by reaction with methacrylic anhydride, which could be confirmed by MNR 1H spectra. Hydrogels were prepared containing PEG-Ch and PEG/Ch-Col on different ratios of collagen, 2 mg mL-1 and 6 mg mL-1, which were obtained by crosslinking using potassium persulfate as initiator and N,N,N’,N’- tetraethylenediamine as activator on two different quantities, 10 mmol and 15 mmol, thus resulting on six different hydrogels systems. Collagen insertion on hydrogels network results in a decrease in the swelling degree, it is also possible to observe collagen on hydrogels network by FTIR-ATR spectra. Biological assays were also done to all hydrogels systems, showing that they presented no toxicity to the cells and could be used as substrate for cell adhesion.